呂布 陳煜 李曦 李嬌妮 臧戰(zhàn) 石耀華 VASQUEZ Hebert Ely,2 鄭興,2 顧志峰,2

(1 海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南海口 570228；2 海南大學(xué)南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

海洋微藻營(yíng)養(yǎng)組成豐富，可以有效地將無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水、二氧化碳和其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機(jī)化合物，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)[1-2]。湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)是一種海洋金黃色鞭毛微藻[3]，是分布于我國(guó)南方湛江灣地區(qū)的海洋浮游單細(xì)胞藻類(lèi)，具有生長(zhǎng)快速、營(yíng)養(yǎng)豐富、不含纖維素細(xì)胞壁、富含多不飽和脂肪酸等特點(diǎn)。該藻可應(yīng)用于不同的飼料工業(yè)和海水養(yǎng)殖系統(tǒng)，如在對(duì)蝦和雙殼類(lèi)幼體養(yǎng)殖中作為優(yōu)質(zhì)餌料等。該藻可在室內(nèi)和室外廣泛養(yǎng)殖并大量生產(chǎn)，具有大規(guī)模培養(yǎng)的潛力。目前有關(guān)湛江等鞭金藻的研究在多不飽和脂肪酸和多糖方面較多，對(duì)其蛋白質(zhì)方面的研究較少[4-5]。該藻的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃[6]，然而我國(guó)南方地區(qū)夏季藻類(lèi)培養(yǎng)池的水溫經(jīng)常高達(dá)35 ℃以上[7]，嚴(yán)重阻礙了其生長(zhǎng)和繁殖，從而提高了生產(chǎn)成本和養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)[8]。

微藻的高密度培養(yǎng)主要分為管道式、平板式、柱式和浮式薄膜袋式等[9-11]。近年來(lái)我國(guó)微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖基地遍布全國(guó)，但養(yǎng)殖基地大多采用玻璃鋼桶、跑道式水泥池等設(shè)施養(yǎng)殖微藻，這些設(shè)施構(gòu)造簡(jiǎn)單、成本低廉、操作方便，但占地面積大，易發(fā)生污染問(wèn)題[12]。有學(xué)者利用聚乙烯薄膜袋培養(yǎng)微藻，顯著降低了生產(chǎn)成本。聚乙烯薄膜袋具有采光面積較大、保溫性能穩(wěn)定、不易被污染、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但薄膜袋易破損漏水，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化培養(yǎng)[13-14]。管道式光生物反應(yīng)器是近年來(lái)微藻戶(hù)外培養(yǎng)時(shí)常用的一種培養(yǎng)裝置，具有光照表面積大、結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微藻生產(chǎn)，可提高微藻生產(chǎn)率和光合效率[11,15-16]，其可靠性、有效性和低成本等優(yōu)點(diǎn)日益引起人們的重視，具有較好的應(yīng)用前景。

本研究通過(guò)比較在管道式光生物反應(yīng)器與傳統(tǒng)聚乙烯袋式培養(yǎng)環(huán)境中湛江等鞭金藻的生長(zhǎng)、葉綠素含量和有機(jī)物含量變化等情況，從藻密度、色素含量和有機(jī)物含量的角度綜合評(píng)價(jià)這2種模式的培養(yǎng)效果，以期為采用管道式光生物反應(yīng)器開(kāi)展室內(nèi)微藻培養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)，并探索湛江等鞭金藻細(xì)胞室內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用湛江等鞭金藻來(lái)自海南大學(xué)海洋學(xué)院微藻保種室。試驗(yàn)前將藻種進(jìn)行純化擴(kuò)培，取快速生長(zhǎng)期的藻液開(kāi)展室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)。

試驗(yàn)用培養(yǎng)液為課題組基于“寧波3#”微藻培養(yǎng)液優(yōu)化所得。具體配方為：化肥尿素50 mg、NaH2PO410 mg、FeSO42.5 mg、MnSO40.25 mg、EDTA-2Na 10 mg、VB16×10-3mg、VB120.5×10-6mg、過(guò)濾海水1 L。

試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)沙井過(guò)濾、沉淀、漂白水消毒后的自然海水。

室內(nèi)培養(yǎng)過(guò)程中的溫度、光照強(qiáng)度、光周期等理化條件為人工控制條件。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年12月—2021年1月在海南省文昌市進(jìn)行。根據(jù)培養(yǎng)模式分為2個(gè)試驗(yàn)組，即管道式光生物反應(yīng)器組和聚乙烯袋組，每組設(shè)3個(gè)平行。管道式光生物反應(yīng)器的供氣系統(tǒng)由泵、輸氣管、調(diào)節(jié)閥組成，工作體積約為1 000 L；聚乙烯袋的工作體積約40 L(見(jiàn)圖1)。試驗(yàn)充氣量在單位體積內(nèi)統(tǒng)一控制在20 L/min，接種細(xì)胞密度約為10.0×104cells/mL。試驗(yàn)水溫維持在(25±1) ℃，光照強(qiáng)度控制在5 500 lx，光暗周期比為12 h∶12 h(光照∶黑暗)，試驗(yàn)持續(xù)16 d。

將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的湛江等鞭金藻用培養(yǎng)基調(diào)整到相同數(shù)量級(jí)(104cells/mL)，經(jīng)離心(3 500 r/min，10 min)后分別接種至1 000 L的管道式光生物反應(yīng)器和40 L的聚乙烯袋中。

各試驗(yàn)組接入藻種并混勻后，每隔24 h進(jìn)行取樣。將樣品依次通過(guò)Whatman GF/C過(guò)濾膜進(jìn)行抽濾，獲得藻細(xì)胞。將收集好的濾膜分別放入離心管中冷凍保存，將藻液留在取樣瓶中，于4 ℃條件下保存。

(a)管道式光生物反應(yīng)器；(b)聚乙烯袋

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 藻細(xì)胞數(shù)目測(cè)定

采用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 藻細(xì)胞干質(zhì)量測(cè)定

預(yù)先稱(chēng)量烘干Whatman GF/C過(guò)濾膜，將一定體積的藻液在該膜上過(guò)濾，經(jīng)過(guò)沖洗去除營(yíng)養(yǎng)鹽，放到105 ℃烘箱中烘干72 h以上后稱(chēng)量，直至前后兩次質(zhì)量差不超過(guò)2 mg，然后計(jì)算烘干后微藻+濾膜與濾膜兩者質(zhì)量的差值，即為藻細(xì)胞的干質(zhì)量[17]。

1.3.3 胞內(nèi)生物質(zhì)測(cè)定

葉綠素含量：利用丙酮萃取法提取微藻體內(nèi)的葉綠素。取待測(cè)藻液樣品20 mL，抽濾至Whatman GF/C膜上，隨后用鑷子將膜取下，置于50 mL離心管底部，加入10 mL的90 %丙酮溶液，立即放入4 ℃冰箱中避光保存1～3 d，在黑暗、低溫條件下進(jìn)行萃取。萃取后，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min。將離心后的提取液上清液小心注入1 cm比色皿中。以90%丙酮溶液作參比，用分光光度計(jì)(島津UV-1700)分別測(cè)定在波長(zhǎng)630、647、664 nm處溶液的吸光度值。計(jì)算減去波長(zhǎng)750 nm下測(cè)得的吸光度值，得到校正后的E664、E647、E630值。按照以下 方程式計(jì)算葉綠素a(Cchla，mg/L)、葉綠素b(Cchlb，mg/L)和總?cè)~綠素(Ctchl，mg/L)的質(zhì)量濃度[18]。

Cchla=(11.85E664-1.54E647-0.08E630)×10/V

(1)

Cchlb=(21.03E647-5.43E664-2.66E630)×10/V

(2)

Ctchl=(20.21E647+8.02E664)×10/V

(3)

式(1)～(3)中，Cchla、Cchlb、Ctchl分別為葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的質(zhì)量濃度(mg/L)，E630、E647、E664分別為在波長(zhǎng)630、647、664 nm處溶液的吸光度值，V為試驗(yàn)用藻液體積(mL)。

總蛋白質(zhì)含量：稱(chēng)取0.1～0.3 g被測(cè)樣品，包于特制錫箔中，并置于自動(dòng)落樣器上。樣品在燃燒反應(yīng)爐(960 ℃)、通氧量170 mL/min條件下充分燃燒300 s，直至氧剩余量為12%時(shí)停止燃燒。燃燒反應(yīng)爐中的試劑依次為280 g氧化銅(CuO)、13 g銀(Ag)絲、15 g鉑(Pb)。燃燒爐中的產(chǎn)物放入TC檢測(cè)器(Rapid N Ⅲ，Elementar公司)檢測(cè)[19]。

可溶性糖含量：稱(chēng)取0.1 g被測(cè)樣品，按照待測(cè)樣本質(zhì)量(g)∶蒸餾水(mL)=1∶10的比例加入蒸餾水，沸水浴加熱60 min。之后取出離心管，再加30 mg活性炭，混勻，放置30 min，過(guò)濾，加3 mL無(wú)水乙醇，再用蒸餾水定容至15 mL。取1 mL提取液于刻度離心管內(nèi)，加5 mL蒽酮試劑，擰上蓋子，沸水浴10 min后，將離心管冰水浴或用自來(lái)水沖洗冷卻至室溫停止反應(yīng)。停止反應(yīng)后20 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得630 nm處的吸光度值，另外用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液以相同的反應(yīng)條件和檢測(cè)方法做標(biāo)準(zhǔn)曲線。比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的可溶性糖含量[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

生產(chǎn)力Px[g/(L·d)]和比生長(zhǎng)速率μ(d-1)通過(guò)下述公式計(jì)算[21]。

Px=(Cm-Ci)/tc

(4)

μ=(lnCm-lnCi)/tc

(5)

式(4)～(5)中，Ci為初始生物量質(zhì)量濃度(g/L)，Cm為最大生物量質(zhì)量濃度(g/L)，tc為與最大生物量濃度有關(guān)的培養(yǎng)時(shí)間(d)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式表示。采用EXCEL 2016和DPS 14.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析法進(jìn)行差異性顯著分析，設(shè)P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率的差異

由表1可見(jiàn)，管道式光生物反應(yīng)器養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻的生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率顯著優(yōu)于聚乙烯袋培養(yǎng)模式(P<0.05)。

表1 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率的差異

2.2 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻生長(zhǎng)密度的差異

在兩種養(yǎng)殖模式下，湛江等鞭金藻的生長(zhǎng)整體均呈先緩慢增長(zhǎng)后快速增長(zhǎng)，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)，最后開(kāi)始降低的趨勢(shì)，但管道式光生物反應(yīng)器模式的變化趨勢(shì)更加明顯(見(jiàn)圖2)。

在管道式光生物反應(yīng)器模式下，湛江等鞭金藻從第4天開(kāi)始進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，其細(xì)胞密度為(0.72±0.09)×106cells/mL，并在第7天細(xì)胞密度達(dá)到峰值，為(1.97±0.14)×106cells/mL，之后開(kāi)始進(jìn)入平穩(wěn)期。在聚乙烯袋模式下，湛江等鞭金藻生長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)平緩，于第9天達(dá)到峰值，其細(xì)胞密度為(0.99 ± 0.02)×106cells/mL，顯著低于管道式光生物反應(yīng)器模式下的峰值(P<0.05)。

注：不同大寫(xiě)字母代表相同養(yǎng)殖模式下不同養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)之間存在顯著性差異，不同小寫(xiě)字母代表相同養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)不同養(yǎng)殖模式之間存在顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.3 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量的差異

兩種養(yǎng)殖模式下，湛江等鞭金藻葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度整體都呈先緩慢增長(zhǎng)后快速增長(zhǎng)，隨后呈穩(wěn)定態(tài)勢(shì)，最后開(kāi)始降低的趨勢(shì)，且管道式光生物反應(yīng)器模式下的變化趨勢(shì)更明顯(見(jiàn)圖3～5)。

圖3 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素a的差異

圖4 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素b的差異

圖5 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻總?cè)~綠素的差異

管道式光生物反應(yīng)器模式下，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度在第4天開(kāi)始進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，并在第7天達(dá)到峰值(分別為0.46、0.44、0.92 mg/L)后進(jìn)入平穩(wěn)期。聚乙烯袋模式下，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)平緩，三者質(zhì)量濃度的峰值顯著低于管道式光生物反應(yīng)器模式下的(P<0.05)。聚乙烯袋組在養(yǎng)殖第9天，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的質(zhì)量濃度分別達(dá)到峰值0.26、0.26、0.52 mg/L。

2.4 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻有機(jī)物含量對(duì)比

在管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式下，湛江等鞭金藻有機(jī)物的質(zhì)量濃度比在聚乙烯袋培養(yǎng)模式下的要高，且二者間有機(jī)物含量存在顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)表2)。管道式光生物反應(yīng)器模式下，湛江等鞭金藻有機(jī)物的最大生物量(干質(zhì)量)、最高總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和最大可溶性糖質(zhì)量濃度分別達(dá)(0.160 1±0.004 0)g/L、(107.267 7±9.632 8)mg/L、(9.587 8±0.868 1)mg/L，均顯著高于聚乙烯袋模式(P<0.05)。湛江等鞭金藻單細(xì)胞胞內(nèi)有機(jī)物的含量?jī)煞N模式之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表2 兩種培養(yǎng)模式下湛江等鞭金藻有機(jī)物含量比較

表3 兩種培養(yǎng)模式下湛江等鞭金藻單細(xì)胞胞內(nèi)有機(jī)物含量比較

3 討論

3.1 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻的生長(zhǎng)及差異

微藻的大規(guī)模培養(yǎng)已成為微藻產(chǎn)業(yè)化中公認(rèn)的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。光生物反應(yīng)器作為生產(chǎn)高附加值微藻產(chǎn)品的技術(shù)平臺(tái)，其中的管道式光生物反應(yīng)器由于發(fā)展快、應(yīng)用廣泛而極具代表性。但在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)方面，各種微藻的最佳培養(yǎng)條件和最低成本消耗仍需不斷地進(jìn)行探索。藻種、外界環(huán)境和培養(yǎng)方式等是微藻培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的影響因素[22]。其中光照是光生物反應(yīng)器最主要的影響因子，影響微藻生長(zhǎng)的主要因素還有溫度、pH等[23]。劉青等[24]使用錐形瓶在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)湛江等鞭金藻，試驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)光照強(qiáng)度梯度，發(fā)現(xiàn)該藻生長(zhǎng)的最適光照強(qiáng)度為5 000 lx，在此光照條件下，其生長(zhǎng)速率最大可達(dá)0.188個(gè)/d，葉綠素質(zhì)量濃度最高為282.64 μg/L。本試驗(yàn)接種的是同一藻種，采用LED燈作為光源，光照強(qiáng)度為5 500 lx，在室內(nèi)溫度為(25±1)℃的條件下，在管道式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，湛江等鞭金藻最大藻密度、比生長(zhǎng)率和葉綠素質(zhì)量濃度分別為1.97×106cells/mL、0.396 7/d和0.92 mg/L，明顯優(yōu)于聚乙烯袋式培養(yǎng)模式和劉青等[24]的試驗(yàn)結(jié)果。這可能是由于管道式光生物反應(yīng)器管徑較小，玻璃材質(zhì)的管壁透光性好，光照均一性好，顯著提高了光照效率[25]，從而促進(jìn)了微藻的快速生長(zhǎng)，提高了培養(yǎng)密度，縮短了培養(yǎng)周期。

3.2 兩種養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素及有機(jī)物含量的差異

不同培養(yǎng)模式會(huì)影響藻細(xì)胞的葉綠素含量。在管道式光生物反應(yīng)器模式和聚乙烯袋模式下，分別在7 d和9 d內(nèi)，湛江等鞭金藻的葉綠素含量均隨著藻細(xì)胞生長(zhǎng)而增加，并在第7天和第9天分別達(dá)到最高值(0.92、0.52 mg/L)。單位水體葉綠素含量的變化反映了藻類(lèi)密度或生物量的變化。當(dāng)藻類(lèi)生長(zhǎng)速率較高時(shí)，生物量一般也較高，二者的變化趨勢(shì)相近[24]。本試驗(yàn)的結(jié)果也表明，在相同的光照強(qiáng)度和周期下，湛江等鞭金藻的葉綠素含量與其比生長(zhǎng)速率成正比，比生長(zhǎng)速率越快，葉綠素含量越高。

本研究發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)周期內(nèi)，管道式光生物反應(yīng)器、聚乙烯袋中湛江等鞭金藻有機(jī)物的質(zhì)量濃度并不一致。在管道式光生物反應(yīng)器模式下，湛江等鞭金藻生物量(干質(zhì)量)和可溶性糖含量顯著高于聚乙烯袋養(yǎng)殖模式。在管道式光生物反應(yīng)器模式下，湛江等鞭金藻的總蛋白質(zhì)含量顯著高于聚乙烯袋模式，主要原因是聚乙烯袋模式培養(yǎng)的藻生物量過(guò)低，導(dǎo)致最后蛋白質(zhì)產(chǎn)量也較低。與董學(xué)衛(wèi)等[26]使用平板式半連續(xù)培養(yǎng)的湛江等鞭金藻相比，本試驗(yàn)管道式光生物反應(yīng)器模式下湛江等鞭金藻的蛋白質(zhì)含量較高，而可溶性糖含量要低于前者試驗(yàn)多糖的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，養(yǎng)殖模式對(duì)湛江等鞭金藻生物量、蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的影響程度不同。其中，管道式光生物反應(yīng)器對(duì)湛江等鞭金藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為顯著。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生產(chǎn)的實(shí)際需求，更好的管道式光生物反應(yīng)器模式將會(huì)被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于微藻規(guī)模化培養(yǎng)，微藻養(yǎng)殖有望成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)新的經(jīng)濟(jì)致富點(diǎn)。

4 結(jié)論

管道式光生物反應(yīng)器可以提高光照效率，有利于湛江等鞭金藻的生長(zhǎng)，縮短其培養(yǎng)時(shí)間，并且適用于微藻的高密度培養(yǎng)。同時(shí)，管道式光生物反應(yīng)器可以解決湛江等鞭金藻生產(chǎn)周期長(zhǎng)及產(chǎn)量不足的問(wèn)題，為其進(jìn)一步的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定了基礎(chǔ)。