戚敏敏 寧維翾 應(yīng)航宇

[摘要] 目的 探討曲安奈德（TAA）外用對(duì)特應(yīng)性皮炎（AD）-哮喘模型小鼠巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）、免疫球蛋白E（IgE）表達(dá)及氣道高反應(yīng)性的影響。 方法 制備AD-哮喘模型，成模小鼠隨機(jī)分為模型（M）組、TAA組，另選取用生理鹽水處理的小鼠為正常對(duì)照（NC）組，每組各12只。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清及肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、IgE及MIF表達(dá)水平。 結(jié)果 與NC組比較，M組小鼠氣道高反應(yīng)性、BALF細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、血清及BALF中IL-4、MIF、IgE水平均增加（P<0.05），BALF中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)、血清及BALF中IFN-γ水平減少（P<0.05）;與M組比較，TAA組小鼠氣道高反應(yīng)性、BALF細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、血清及BALF中IL-4、MIF、IgE水平均降低（P<0.05），BALF中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)、血清及BALF中IFN-γ水平增加（P<0.05）。 結(jié)論 TAA可減輕AD-哮喘模型小鼠皮膚炎癥及氣道高反應(yīng)性，可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡和降低MIF、IgE表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 曲安奈德;特應(yīng)性皮炎;巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子;免疫球蛋白E

[中圖分類(lèi)號(hào)] R246.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）13-0020-05

[Abstract] Objective To explore the effect of external use of triamcinolone acetonide （TAA） on the expression of MIF and IgE and airway hyperresponsiveness in atopic dermatitis-asthma model mice. Methods The AD-asthma model was prepared. The model mice were randomly divided into the model （M） group and the TAA group， and other mice treated with saline were selected as the normal control （NC） group， with 12 mice in each group. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the expression levels of interleukin-4 （IL-4），interferon-γ（IFN-γ），IgE and MIF in serum and bronchoalveolar lavage fluid （BALF）. Results Compared with the NC group， the airway hyperresponsiveness， total number of BALF cells， number of eosinophils， and levels of IL-4，MIF and IgE in serum and BALF were increased in the M group （P<0.05），and the number of lymphocytes and monocytes in BALF，and IFN-γ level in BALF were decreased in the M group（P<0.05）.Compared with the M group， the airway hyperresponsiveness， total number of BALF cells， number of eosinophils， and levels of IL-4，MIF，and IgE in serum and BALF were decreased in the TAA group（P<0.05）， and the number of lymphocytes and monocytes in BALF，and IFN-γ level in serum and BALF were increased in the TAA group（P<0.05）. Conclusion TAA can reduce skin inflammation and airway hyperresponsiveness in AD-asthma model mice，which may be related to regulating Th1/Th2 balance and reducing the expression of MIF and IgE.

[Key words] Triamcinolone acetonide; Atopic dermatitis; Macrophage migration inhibitory factor; Immunoglobulin E

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種慢性過(guò)敏性疾病，易復(fù)發(fā)且伴隨劇烈瘙癢癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，近年來(lái)AD發(fā)病率呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。值得關(guān)注的是AD在青少年及成人階段常并發(fā)哮喘或過(guò)敏性鼻炎等炎癥性氣道過(guò)敏性疾病，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AD是哮喘發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。AD是皮膚科常見(jiàn)難治性疾病，并發(fā)哮喘更是增加治療難度，目前臨床尚無(wú)特效療法。研究發(fā)現(xiàn)，AD-哮喘多以2型輔助性T細(xì)胞（T helper 2type cell，Th2）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為主，存在免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）及Th2型細(xì)胞因子分泌升高，嗜酸性粒細(xì)胞增多[3]，而巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）在哮喘等自身免疫性疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要促炎、免疫抑制作用[4-5]。曲安奈德（triamcinolone acetonide，TAA）是一種具有抗炎、抗過(guò)敏及免疫抑制作用的中效型糖皮質(zhì)激素，具有皮膚滲透性，且局部用藥可避免全身激素應(yīng)用副作用，可用于治療各種皮膚病及口腔潰瘍等疾病[6-8]，對(duì)兒童AD治療有一定效果[9]，但目前關(guān)于TAA對(duì)AD-哮喘的作用尚無(wú)報(bào)道。因此本研究通過(guò)建立AD-哮喘小鼠模型，擬探究TAA外用涂抹局部皮損處的治療作用及對(duì)AD-哮喘模型小鼠MIF、IgE表達(dá)及氣道高反應(yīng)性的影響，以期揭示其作用機(jī)制，為臨床AD-哮喘治療提供新的方案及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。C5BBB0AC-E93A-4337-8604-5BEA963A4FF7

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠，體重16～18 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0002。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 主要試劑及儀器

曲安奈德益康唑乳膏，規(guī)格：曲安奈德1 mg，硝酸益康唑10 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20074155，購(gòu)自華潤(rùn)三九（南昌）藥業(yè)有限公司;卵清蛋白（ovalbumin，OVA，貨號(hào)：A5503）、二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB，貨號(hào)：101397）、乙酰甲膽堿（methacholine，Mch，貨號(hào)：PHR1943）均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab221833）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（貨號(hào)：239425）、IgE ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab157718）及MIF ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab209885）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Flexivent小動(dòng)物肺功能儀購(gòu)自法國(guó)EMKA公司;FC型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司等。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組? BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)制備AD-哮喘模型小鼠[10]，具體方法：小鼠進(jìn)行背部脫毛，面積約2 cm×3 cm，實(shí)驗(yàn)前2 d小鼠背部脫毛區(qū)涂抹25 ml 7% 二硝基氯苯DNCB，第6～8天小鼠背部脫毛區(qū)涂抹40 ml 1% DNCB，其中每4 d涂抹40 ml OVA（40 g OVA）誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎。21～27天小鼠通過(guò)氣道霧化吸入1% OVA，30 min/d，誘導(dǎo)哮喘模型。成模小鼠隨機(jī)分為模型（M）組、曲安奈德（TAA）組，另選取用生理鹽水處理的小鼠為正常對(duì)照（NC）組，每組各12只。NC組、M組小鼠正常飼養(yǎng)無(wú)任何治療，TAA組小鼠在21～27 d通過(guò)氣道霧化吸入1% OVA后1 h，背部脫毛區(qū)進(jìn)行TAA膏涂抹，每天1次。末次涂抹治療48 h后評(píng)估各組小鼠氣道高反應(yīng)，采集血清、皮損處組織、肺泡灌洗液（bronchoalveo larlavage fluid，BALF）、肺組織標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.2 氣道高反應(yīng)性測(cè)定? 治療結(jié)束后48 h，采用小動(dòng)物肺功能儀測(cè)定小鼠氣道阻力，記錄小鼠氣道阻力基礎(chǔ)值1 min后，測(cè)定30 ml生理鹽水（normal saline，NS）和30 ml不同濃度（3.12 mg/ml、6.25 mg/ml、12.50 mg/ml、25.00 mg/ml、50.00 mg/ml、100.00 mg/ml）乙酰甲膽堿（Mch）霧化激發(fā)后小鼠氣道阻力變化，每次霧化1 min，記錄3 min。以NS增強(qiáng)的呼吸間歇（enchanced pause，Penh）為標(biāo)準(zhǔn)值，以Mch-Penh/NS-Penh比值作為評(píng)價(jià)氣道高反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

1.3.3 皮損組織炎癥評(píng)估? 觀察小鼠皮損處外觀表現(xiàn)。麻醉處死各組小鼠，采集皮損組織置于10%甲醛中進(jìn)行固定、石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosinstaining，HE）染色，光鏡下觀察皮損病理學(xué)變化。

1.3.4 BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)? 處死小鼠后，行氣管插管，用預(yù)冷8 ml PBS灌洗，收集BALF，取1 ml進(jìn)行500 r/min離心5 min，吸取細(xì)胞沉淀，PBS重懸后進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)，部分細(xì)胞懸液甩片后吉姆薩染色，進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。

1.3.5 肺組織病理學(xué)變化檢測(cè)? 留取右肺組織，10%甲醛固定、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.3.6 血清及BALF中IL-4、IFN-γ、MIF、IgE水平檢測(cè)? 采集各組小鼠動(dòng)脈血，常規(guī)離心后留取血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清及BALF中IL-4、IFN-γ、MIF、IgE表達(dá)水平，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，任意兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚組織病理學(xué)變化

NC組小鼠背部皮膚基本正常，HE染色無(wú)明顯病理改變;M組小鼠背部皮膚可見(jiàn)明顯紅斑、鱗屑，HE染色發(fā)現(xiàn)皮損處組織表皮角化不全、棘細(xì)胞層明顯增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);TAA組小鼠皮膚外觀及HE染色病理變化較M組減輕。見(jiàn)封三圖10～11。

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化

NC組小鼠肺組織無(wú)明顯病理變化，M組小鼠可見(jiàn)支氣管周?chē)胺闻蓍g隔區(qū)均有大量炎性細(xì)胞，TAA組炎性細(xì)胞明顯減少。見(jiàn)封三圖12。

2.3 各組小鼠氣道高反應(yīng)性變化

給予不同濃度Mch吸入后，NC組、M組、TAA組小鼠氣道高反應(yīng)性均呈上升趨勢(shì)（P<0.05）。同一濃度Mch作用下，與NC組比較，M組小鼠氣道高反應(yīng)性顯著升高（P<0.05）;與M組比較，TAA組小鼠氣道高反應(yīng)性顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 各組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類(lèi)變化

與NC組比較，M組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.05）;與M組比較，TAA組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著減少，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。見(jiàn)表2。C5BBB0AC-E93A-4337-8604-5BEA963A4FF7