徐海菊，馮尚坤，陳正冬，鮑若晗

（臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院，浙江臺(tái)州 318020）

隨著人類對(duì)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)需求的不斷增長(zhǎng)，海洋藻類作為新型蛋白質(zhì)的來(lái)源越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。壇紫菜（Porphyra haitanensis），隸屬紅藻門（Rhodophyta）、紅藻綱（Rhodophyceae）、紅毛菜科（Bangiaceae）、法紫菜屬（Pyropia），是一種生長(zhǎng)在沿海潮間帶中高潮區(qū)的巖礁或筏架上的大型藻類，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)海藻之一，主要分布在浙江、福建和廣東等省[1-3]。

壇紫菜味道鮮美，含有大量人體所必需的蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，有著“營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”的美稱[4-6]。壇紫菜蛋白質(zhì)含量達(dá)到31.33%～50.94%，脂肪含量0.34%～1.04%，具有低脂肪高蛋白的特點(diǎn)[7]。針對(duì)這一特點(diǎn)，對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行研究和綜合開(kāi)發(fā)利用，可以提供人們對(duì)于高品質(zhì)蛋白質(zhì)的需求。但目前對(duì)于壇紫菜蛋白質(zhì)的提取與特性研究較少，而且不同種類的紫菜蛋白在含量、組成與特性方面存在較大差異，因此開(kāi)展壇紫菜蛋白的提取工藝和特性研究，對(duì)提高壇紫菜原料附加值具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)提取方法如水溶液提取法、組織破碎法和反復(fù)凍融法，存在著產(chǎn)品耗時(shí)長(zhǎng)、易變性、提取率低和能耗高等缺點(diǎn)。隨著提取技術(shù)的發(fā)展，新型提取方法如超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和液氮研磨法被應(yīng)用到蛋白質(zhì)的提取過(guò)程中，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、安全環(huán)保、無(wú)化學(xué)殘留、耗時(shí)短、效率高等優(yōu)勢(shì)。本研究以壇紫菜為原料，研究開(kāi)發(fā)一種超聲波輔助提取壇紫菜蛋白質(zhì)的方法，并對(duì)其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及抗氧化特性進(jìn)行研究，旨在為壇紫菜資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

壇紫菜 采自浙江省臺(tái)州市路橋海勝水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，水洗，除去泥沙等雜質(zhì)，晾干備用；總蛋白定量測(cè)試盒（BCA法）、ABTS試劑盒、T-AOC測(cè)定試劑盒

南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DPPH 色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硫酸銨等 均為分析純；金龍魚(yú)大豆油 超市購(gòu)買。

DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；JY99-IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Avanti J-26高速冷凍離心機(jī)

貝克曼庫(kù)特爾；SUNRISE吸光酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；GB204電子天平 瑞士METTLER公司；FOSS 2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海艾研生物科技有限公司；Delta320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器公司；751石英比色皿 宜興市偉鑫儀器有限公司；Alpha1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ；UV2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本SHIMADZU公司；T50均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波法輔助提取蛋白的單因素實(shí)驗(yàn) 壇紫菜蛋白提取工藝流程[8-10]：壇紫菜→50 ℃烘干至恒重→高速粉碎機(jī)粉碎→過(guò)120目篩→稱取藻粉→按料液比（w:v）加入溶劑→磁力攪拌器攪拌均勻→超聲輔助提取→4 ℃，10000 r/min離心15 min→取上清液→測(cè)定蛋白含量。

以上工藝流程中蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算公式如下：

式中，壇紫菜粉蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法，上清液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用BCA試劑盒測(cè)定。

單因素實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[9-10]，考察了不同溶劑（蒸餾水、20 mmol/L pH7.0 PBS、20 mmol/L CaCl2）、超聲發(fā)生時(shí)間和間隔時(shí)間（2、3、4、5、6、7、8 s）、料液比（50:4、50:5、50:6、50:7、50:8、50:9、50:10 mg/:mL）、pH（3、4、5、6、7、8、9）、超聲功率（180、540、900、1260、1440、1620 W）和超聲全程時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)壇紫菜蛋白提取率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，其他條件分別按固定為蒸餾水、超聲發(fā)生時(shí)間和超聲間隔時(shí)間為4 s、料液比50:5 mg/mL、pH7、超聲功率1260 W、超聲全程時(shí)間20 min。

1.2.2 壇紫菜粉蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[11]。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以超聲全程時(shí)間（A）、pH（B）、超聲功率（C）確定正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)自變量及水平，以蛋白質(zhì)提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，以確定超聲處理的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor level charts of orthogonal test

1.2.4 壇紫菜蛋白制備過(guò)程中的光譜學(xué)特征 壇紫菜蛋白的制備工藝流程：超聲離心得到的蛋白溶液，裝入透析袋，放入飽和度為60%硫酸銨溶液中鹽析，在4 ℃下靜置過(guò)夜后，離心20 min（4 ℃，4900 r/min），收集沉淀，加入少量蒸餾水溶解后置于透析袋除鹽，在4 ℃下連續(xù)透析48 h，中間換水4～5次，截留液用PEG 20000濃縮后冷凍干燥得到蛋白質(zhì)粉末。

對(duì)不同工藝階段后的組分進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描，得到光譜掃描圖。

1.2.5 壇紫菜蛋白特性分析

1.2.5.1 等電點(diǎn)的測(cè)定 取得到的蛋白提取液，50 mL共7份，調(diào)整pH分別為3、4、4.5、5、6、7、8、9；

10000 r/min離心分離15 min后取上清液，用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，記錄在595 nm處的吸光度，吸光度最小時(shí)的pH即為壇紫菜蛋白的等電點(diǎn)。

1.2.5.2 乳化性質(zhì)的測(cè)定 根據(jù)Pearce等[12]的方法測(cè)定。配制6 mL 0.1%（w/v）的樣品復(fù)溶液，將pH分別調(diào)到3.5、4、4.5、5、5.5然后加入2 mL的金龍魚(yú)大豆油，利用高速分散器1×104r/min均質(zhì)1 min后，立刻從底部取25 μL樣液，加入0.1%的SDS溶液5 mL混勻。以SDS溶液為空白，測(cè)定其在500 nm處的吸光值。放置15 min后，再測(cè)定一次。乳化活性及乳化穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下：

式中：C為溶液中的蛋白質(zhì)濃度（g蛋白/mL）；φ為油相在乳化液中所占的比例（0.25）；L為比色杯寬度（1 cm）；N為稀釋倍數(shù)；A0為初始乳化液的吸光度值；A15為15 min后的吸光度值。

1.2.5.3 起泡性質(zhì)的測(cè)定 參照Fernandez等[13]的方法略有改動(dòng)。取20 mL 2%（w/v）的蛋白溶液，分別調(diào)pH至3.5、4、4.5、5、5.5后，在高速分散器中以1×104r/min均質(zhì)2 min，測(cè)量此時(shí)泡沫和溶液的總體積V0及攪拌停止30 min后泡沫和溶液的總體積V1，起泡性及泡沫穩(wěn)定性按如下公式表示：

式中：V0表示攪拌停止時(shí)泡沫和溶液的總體積，mL；V1表示攪拌停止30 min后泡沫和溶液的總體積，mL。

1.2.5.4 壇紫菜蛋白質(zhì)的抗氧化能力測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。樣品濃度0、5、10、20、40、50 mg/mL，每個(gè)濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值，按下式計(jì)算總抗氧化能力。

1.2.5.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定 采用96孔板測(cè)定樣品的DPPH自由基清除活性[14]。在96孔板內(nèi)，精確移取20 μL樣品（濃度0～10 mg/mL）+180 μL的0.2 mmol/L的DPPH溶液，室溫下將二者混合均勻，避光放置30 min，517 nm處測(cè)定其吸光值，用A樣品表示。空白組以無(wú)水乙醇代替樣品，對(duì)照組以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，其吸光值分別用A對(duì)照和A空白表示。以Trolox做陽(yáng)性對(duì)照。

式中：A樣品表示樣品+DPPH；A對(duì)照表示樣品+無(wú)水乙醇；A空白表示無(wú)水乙醇+DPPH。

1.2.5.6 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 參照ABTS試劑盒說(shuō)明書(shū)配制ABTS所需工作溶液。用樣品配制溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，把10 mmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1 mmol/L。于96孔板內(nèi)分別加入工作液和樣品，將加好樣品的孔板混和均勻，室溫孵育6 min后測(cè)定405 nm處的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖，采用SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Ducan氏法進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 壇紫菜粉蛋白質(zhì)含量

本實(shí)驗(yàn)所采用的原料壇紫菜的蛋白質(zhì)含量為21.02%±0.11%（以干基計(jì)），遠(yuǎn)高于海帶（10.2%～10.7%）[15]、脆江蘺（10.12%～14.13%）[16]和羊棲菜（6.05%）[17]中蛋白質(zhì)含量，表明壇紫菜是一種蛋白含量較高的可食用海藻資源。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同溶劑對(duì)提取率的影響 由表2可知，用不同溶劑溶解壇紫菜粉時(shí)，進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞后得到的蛋白質(zhì)提取率有所不同，其中以蒸餾水和20 mmol/L pH7.0 PBS為溶劑進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎后，蛋白質(zhì)提取率顯著高于以20 mmol/L CaCl2為溶劑時(shí)的提取率（P＜0.05）?？紤]到簡(jiǎn)便操作，本實(shí)驗(yàn)選取蒸餾水為溶劑。

表2 不同溶劑時(shí)的壇紫菜蛋白質(zhì)提取率Table 2 Protein extraction rate of Porphyra haitanensis in different solvents

2.2.2 超聲間隔時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖1可見(jiàn)，固定超聲發(fā)生時(shí)間為4 s時(shí)，隨著超聲間隔時(shí)間的增加，壇紫菜蛋白質(zhì)的提取率先上升后迅速下降，在4 s時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，在5～7 s范圍內(nèi)保持平穩(wěn)，到達(dá)8 s時(shí)又迅速下降，之后隨著超聲間隔時(shí)間的增加，超聲實(shí)際作用時(shí)間減少，不利于蛋白質(zhì)的溶出。因此，選擇超聲細(xì)胞破碎儀的占空比為50%（即超聲發(fā)生時(shí)間4 s，超聲間隔時(shí)間4 s），此時(shí)超聲破碎效率最高。

2.2.3 料液比對(duì)提取率的影響 從圖2可見(jiàn)，隨料液比的增加，壇紫菜蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為50:8 mg/mL時(shí)，提取率達(dá)到最大，達(dá)到47.28%，其他后隨著料液比的增加，提取率開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。這是由于當(dāng)溶劑用量較低時(shí)，藻粉溶液粘度大，液體難以產(chǎn)生空化泡，導(dǎo)致超聲波處理效果弱化；隨著溶劑用量增大，溶液粘度降低，超聲波的空化作用加強(qiáng)，蛋白質(zhì)提取率上升；當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，由于細(xì)胞壁破裂導(dǎo)致的內(nèi)容物大量溶出，使得溶液的粘度大幅升高，影響了蛋白質(zhì)的溶出量，因而提取率下降[18]。此外，料液比過(guò)高帶來(lái)提取液中蛋白質(zhì)濃度降低的問(wèn)題，這也是實(shí)際生產(chǎn)時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮的問(wèn)題。

圖 1 超聲間隔時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic interval time on protein extraction rate

圖 2 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on protein extraction rate

2.2.4 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，在pH3～9范圍內(nèi)，溶液pH對(duì)舌狀蜈蚣藻蛋白質(zhì)提取率的影響比較明顯。隨著pH的增大，提取率呈現(xiàn)先增加隨后趨于平衡的趨勢(shì)，當(dāng)pH為7時(shí)達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)殡S著pH的升高，兩性解離性質(zhì)使得蛋白質(zhì)分子的表面電荷增加，蛋白質(zhì)對(duì)水的親和性增強(qiáng)，與此同時(shí)，一部分非水溶性蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘牡鞍祝坏钱?dāng)pH升高到偏堿性條件時(shí)，蛋白質(zhì)容易變性，導(dǎo)致在水溶液中的溶解度降低，使得提取率稍有降低[19]。

2.2.5 超聲功率對(duì)提取率的影響 由圖4可見(jiàn)，隨著超聲功率的增加，蛋白質(zhì)的提取率呈現(xiàn)逐漸提高趨勢(shì)，在1260 W處到達(dá)最高點(diǎn)后降低，各處理組間存在顯著性差異（P＜0.05）。超聲功率影響超聲作用，超聲功率越高，空化強(qiáng)度越大，超聲效果越好，有效成分分離越快。在超聲功率較小時(shí)，超聲強(qiáng)度不足以完全破碎細(xì)胞壁，隨著空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子與水分子之間相互作用增強(qiáng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解[20]。到達(dá)1260 W時(shí)，蛋白質(zhì)得以完全充分地溶出，然而繼續(xù)增大超聲功率，產(chǎn)生的熱效應(yīng)使部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性，形成沉淀，在后續(xù)操作中被除去，因此提取率下降?？紤]到生產(chǎn)成本和儀器使用壽命，超聲波功率選擇1080～1440 W較為合適。

圖 3 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of pH on protein extraction rate

圖 4 超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on protein extraction rate

圖 5 超聲全程時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of whole ultrasonic time on protein extraction rate

2.2.6 超聲全程時(shí)間對(duì)提取率的影響 由圖5可見(jiàn)，保持其它條件不變，改變超聲全程時(shí)間時(shí)，壇紫菜蛋白質(zhì)提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后下降。與對(duì)照組（0 min，即未經(jīng)過(guò)超聲處理）相比，處理組的蛋白質(zhì)提取率顯著提高（P＜0.05）。由于溶脹作用，對(duì)照組中也會(huì)有蛋白質(zhì)溶出，這正是溶脹法提取蛋白的原理。但由于溶脹法的效率太低，不利于實(shí)際的大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)也說(shuō)明了利用超聲波破碎細(xì)胞壁提取蛋白質(zhì)的必要性。

在0～50 min范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白質(zhì)提取率升高，這是因?yàn)檠娱L(zhǎng)超聲時(shí)間能讓更多細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)更多地溶解出來(lái)。當(dāng)時(shí)間超過(guò)50 min時(shí)，溶液溫度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，原本位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)分子間通過(guò)非共價(jià)鍵相互聚集形成沉淀，因此蛋白質(zhì)提取率下降[21]。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表3可見(jiàn)，各因素對(duì)壇紫菜蛋白質(zhì)提取率的影響程度不一致。影響由大到小分別為：A＞C＞B，即超聲全程時(shí)間對(duì)提取率的影響最大，其次是超聲功率，最后是pH，最優(yōu)水平組合為A2B2C3，即超聲全程時(shí)間50 min，pH7，超聲功率1350 W。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

從正交表中可以看出，最優(yōu)水平組合A2B2C3并不在正交試驗(yàn)的9組實(shí)驗(yàn)中，因此在A2B2C3（超聲時(shí)間50 min，pH7，超聲功率1350 W）條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得壇紫菜蛋白質(zhì)的提取率為60.98%±1.01%。以同樣作為藻類蛋白的提取工藝為參考，提取率在50%左右[22-24]。

2.4 壇紫菜蛋白質(zhì)制備過(guò)程中的紫外-可見(jiàn)光光譜特征

將超聲破碎提取得到的上清液、鹽析后蛋白提取液以及透析后的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描，得到完整的光譜掃描圖如圖6～圖8所示。

圖6中出現(xiàn)了4個(gè)吸收峰，分別在326、494、540、668 nm處。326 nm處的特征吸收峰，說(shuō)明上清液中含有維生素等物質(zhì)，因?yàn)榫S生素等物質(zhì)的特征吸收峰在330 nm附近[25]。668 nm處的吸收峰則表明蛋白提取液中含有少量的葉綠素a[26]。

圖 6 超聲后蛋白提取液吸收光譜圖Fig.6 Absorption spectrogram of protein extract after ultrasound

圖 7 鹽析后蛋白提取液吸收光譜圖Fig.7 Absorption spectrogram of protein extract after salting out

圖 8 透析后蛋白提取液吸收光譜圖Fig.8 Absorption spectrogram of protein extract after dialysis

如圖7所示，鹽析后的蛋白提取液的4個(gè)吸收峰，分別在495、541、612、672 nm處。與鹽析之前對(duì)比，326 nm處的高吸收峰消失，說(shuō)明通過(guò)鹽析除去了大部分的維生素等雜質(zhì)。同時(shí)，經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析，蛋白質(zhì)的濃度有所提高，從而使得612 nm處的微弱吸收峰顯現(xiàn)出來(lái)，說(shuō)明上清液中可能存在藻藍(lán)蛋白，因?yàn)樵逅{(lán)蛋白的特征吸收峰在620 nm附近。而圖8在495和544 nm處存在吸收峰，說(shuō)明經(jīng)過(guò)透析后，藻藍(lán)蛋白的吸收峰消失，提示若想從壇紫菜蛋白質(zhì)提取物中進(jìn)一步獲得高純度的藻紅蛋白，鹽析和透析等分離純化操作是必要的[27]。

從圖6～圖8可以看出，上清液在220～280 nm曲線吸收較高，是因?yàn)榇蟛糠职被嵩谧贤鈪^(qū)的吸收峰多集中在200～220 nm，苯丙氨酸（Phe）的吸收峰在222與259 nm，酪氨酸（Tyr）的吸收峰在231及272 nm，色氨酸（Trp）的吸收峰在227與279 nm[26]。

同時(shí)，通過(guò)對(duì)比超聲提取液、鹽析液及透析后溶液吸收光譜的特征吸收峰，可以發(fā)現(xiàn)吸收峰的紅移現(xiàn)象，如表4所示。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白質(zhì)的純度、溶液pH不同都會(huì)影響其光譜特性[27]。

表4 壇紫菜蛋白質(zhì)制備過(guò)程中溶液吸收光譜圖的特征吸收峰Table 4 Characteristic absorption peaks of solution absorption spectra during protein preparation of Porphyra haitanensis

2.5 壇紫菜蛋白質(zhì)的特性

2.5.1 等電點(diǎn) 由圖9可見(jiàn)，當(dāng)pH在3～9變化時(shí)，吸光度值先下降然后上升，在pH4.5時(shí)，吸光度達(dá)到低谷，蛋白質(zhì)的溶解度最小，說(shuō)明此點(diǎn)即為壇紫菜蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

圖 9 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果Fig.9 Determination results of protein isoelectric point

圖 10 壇紫菜蛋白質(zhì)的pH-乳化活性Fig.10 pH-emulsifying activity of Porphyra haitanensis protein

2.5.2 乳化性質(zhì) 圖10所示為壇紫菜蛋白質(zhì)的乳化活性（EAI）隨pH的變化情況。從圖中可看出，在3.5～5.5范圍內(nèi)，隨著pH增大，蛋白質(zhì)的乳化活性先減弱后增強(qiáng)，在pH4.5時(shí)乳化活性最差。接近pI時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度小，對(duì)乳化作用的影響小。偏離pI時(shí)，蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的離解，產(chǎn)生了有利于乳化體系穩(wěn)定的靜電斥力，避免了液滴聚集[28]。

由圖11可見(jiàn)，與乳化活性一致，pH4.5時(shí)壇紫菜蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性達(dá)到最低值。這可能是由于蛋白濃度較低時(shí)，分子間相互作用較大，蛋白質(zhì)與油相互作用較小，因此空氣-油界面形成的膜較薄且不穩(wěn)定[29]。壇紫菜蛋白在pH5.5時(shí)乳化活性可達(dá)112.49±5.33 m2/g，乳化穩(wěn)定性為40.52±1.08 min，其乳化活性遠(yuǎn)高于吳鳳娜[30]提取的海帶蛋白（40 m2/g），但乳化穩(wěn)定性與其（105 min）相比則較低。這也提示，壇紫菜蛋白質(zhì)具有開(kāi)發(fā)成天然乳化劑的潛力，可通過(guò)物理、化學(xué)和生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)改性，使其獲得更加良好的乳化性質(zhì)。

圖 11 圖11 壇紫菜蛋白質(zhì)的pH-乳化穩(wěn)定性Fig.11 pH-emulsifying stability of Porphyra haitanensis protein

2.5.3 起泡性質(zhì) 由圖12可見(jiàn)，在pH3.5～5.5范圍內(nèi)，隨著pH增大，壇紫菜蛋白質(zhì)的起泡性呈現(xiàn)先減弱后增強(qiáng)的趨勢(shì)，在pH4.5時(shí)起泡性最差。這可能是由于偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解性增強(qiáng)，使蛋白質(zhì)黏度下降，從而增加了蛋白質(zhì)的起泡性。在pH3.5～5.5時(shí)，壇紫菜蛋白質(zhì)的起泡性在20.25%～24.75%范圍內(nèi)變動(dòng)，而李玉娥等[31]提取的燕麥分離蛋白在pH2～9時(shí)，起泡性在8%～21%范圍內(nèi)變動(dòng)。

圖 12 pH對(duì)蛋白質(zhì)起泡性的影響Fig.12 Effect of pH on protein foaming

由圖13可見(jiàn)，壇紫菜蛋白質(zhì)的泡沫體系在接近pI時(shí)很穩(wěn)定，一般來(lái)說(shuō)具有良好發(fā)泡能力的蛋白質(zhì)其泡沫穩(wěn)定性一般很差。壇紫菜蛋白質(zhì)在pH4.5時(shí)泡沫穩(wěn)定性可達(dá)80.84%±2.95%，而許英一等[32]從提取的燕麥蛋白的泡沫穩(wěn)定性最高在60%左右，吳鳳娜[30]提取的海帶蛋白的泡沫穩(wěn)定性最高在80%左右，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)提取的壇紫菜蛋白質(zhì)具有良好的泡沫穩(wěn)定性。

圖 13 pH對(duì)蛋白質(zhì)起泡穩(wěn)定性的影響Fig.13 Effect of pH on protein foaming stability

2.6 壇紫菜蛋白質(zhì)的抗氧化能力

2.6.1 總抗氧化能力 由圖14可知，在0～50 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度提高，壇紫菜蛋白質(zhì)總抗氧化能力先提高后趨于穩(wěn)定，存在一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度為50 mg/mL時(shí)，壇紫菜蛋白質(zhì)的T-AOC值為2.89±0.09 U/mL，表明壇紫菜蛋白具有一定的抗氧化能力?？偪寡趸芰Γ═-AOC）能夠反映被測(cè)物中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、生物學(xué)研究中用于檢測(cè)各種抗氧化物溶液的綜合抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示壇紫菜蛋白質(zhì)具有開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑的潛力。

圖 14 壇紫菜蛋白質(zhì)的總抗氧化能力Fig.14 Total antioxidant capacity of Porphyra haitanensis protein

2.6.2 DPPH自由基清除能力 壇紫菜蛋白質(zhì)對(duì)DPPH的清除作用見(jiàn)圖15。在0～10 mg/mL范圍內(nèi)，壇紫菜蛋白質(zhì)對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出一定的清除活性，且與其濃度水平成量效關(guān)系，即隨濃度得升高，對(duì)DPPH的清除率也增強(qiáng)。經(jīng)SPSS 22.0軟件計(jì)算，其DPPH半數(shù)清除濃度IC50為3.79 mg/mL。壇紫菜蛋白質(zhì)對(duì)DPPH的清除作用低于Trolox。

圖 15 壇紫菜蛋白質(zhì)的DPPH自由基清除能力Fig.15 DPPH free radical scavenging capacity of Porphyra haitanensis protein

當(dāng)壇紫菜蛋白濃度10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH的清除率達(dá)到68.04%±0.73%。而胡雙飛等[14]所提取的螺旋藻粗蛋白，其DPPH清除率在10 mg/mL時(shí)接近60%，顯著高于傳統(tǒng)水提取方法提取的粗蛋白DPPH清除率，表明本實(shí)驗(yàn)所提取的壇紫菜蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

2.6.3 ABTS+自由基清除能力 以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖16所示。

圖 16 Trolox溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.16 Standard curve of Trolox solution

如圖17所示，當(dāng)樣品濃度從5到50 mg/mL時(shí)，壇紫菜蛋白質(zhì)的TEAC值先增加后趨于穩(wěn)定，表明壇紫菜蛋白質(zhì)對(duì)ABTS+自由基有一定的清除作用。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?0 mg/mL時(shí)，TEAC值達(dá)到0.83±0.08 mmol/L，即相當(dāng)于具有0.83倍Trolox的ABTS+自由基清除能力。

圖 17 壇紫菜蛋白質(zhì)的TEAC值Fig.17 TEAC value of Porphyra haitanensis protein

由上述抗氧化結(jié)果分析可知，當(dāng)壇紫菜蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)增加時(shí)，清除自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。增大到一定程度時(shí)，清除自由基的能力增長(zhǎng)的趨勢(shì)越來(lái)越緩慢，清除率難以達(dá)到較高水平。有文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白質(zhì)在經(jīng)體外模擬胃腸液消化后抗氧化能力增強(qiáng)[33-34]，而與蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物的抗氧化作用緊密相關(guān)的是消化產(chǎn)物中的小分子肽類。生物活性肽所具有的功能活性比蛋白質(zhì)更加豐富，這也提示，對(duì)于壇紫菜蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用，可以從酶解獲得生物活性肽的方面進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

本研究以壇紫菜為原料，確定了超聲輔助提取壇紫菜蛋白質(zhì)的最適提取工藝，其提取率達(dá)到60.98%±1.01%；對(duì)所提取的壇紫菜蛋白質(zhì)特性指標(biāo)和抗氧化特性分析顯示其溶液具有較好的泡沫穩(wěn)定性，壇紫菜蛋白質(zhì)在5～50 mg/mL范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，濃度為50 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力為2.89±0.09 U/mL，ABTS+自由基清除能力相當(dāng)于0.83±0.08 mmol/L Trolox，DPPH清除率在10 mg/mL時(shí)達(dá)到68.04%±0.73%。本研究?jī)?nèi)容是對(duì)壇紫菜蛋白質(zhì)提取工藝和其特性的初步研究，下一步有待對(duì)其分離純化，分子結(jié)構(gòu)等方面開(kāi)展研究，并根據(jù)其特性將提取到的壇紫菜蛋白應(yīng)用于食品、化工等領(lǐng)域以發(fā)揮其功效作用。