張 佳，田 雪，賈永秀，詹祉婧，隋文杰, ，張 民,2，劉 銳，吳 濤

（1.天津科技大學食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300392）

肉桂為樟科樟屬植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl.）的干燥樹皮，是具有暖甜、辛辣風味的濃香型香料，在食品調味、保鮮、抑菌消炎等方面有重要作用[1-2]。肉桂中含有1.2%～4.6%的揮發(fā)油，為淡黃色油狀液體，具有藥草、辛香-藥草香風味及甜味，應用范圍廣泛，包括烘焙食物、酒精飲料、牙膏和口香糖等[3-4]。其揮發(fā)油中風味成分復雜，產量和組成比例受品種、預處理及提取手段等影響[5]。

目前，提取肉桂揮發(fā)油的方法包括水蒸氣蒸餾、超聲、微波輔助提取[6-7]及超臨界流體萃取[8]等。其中，傳統的水蒸氣蒸餾法操作簡便，但具有揮發(fā)油提取得率低、耗時長和操作溫度高等不足[9]；對于新型的超聲、微波輔助提取法，在揮發(fā)油提取得率上有所提升，但其對設備有一定要求[9-10]；超臨界流體萃取法具有過程高效、產品雜質成分少等優(yōu)勢，但其操作略復雜且生產成本高[11]。雙水相萃?。ˋqueous twophase extraction，ATPE）是一種條件溫和、傳質速度快、分相時間較短且溶劑易回收的新型萃取分離技術[12]。根據待萃取物在互不相溶兩水相間的選擇性分配，原料進入體系后，在疏水作用、電荷作用以及各種力（如氫鍵）的共同作用下，其有效成分在兩相中以不同速度分配而達到快速分離。因此，雙水相體系作為萃取介質，對目標物的萃取目的性和高效性強。研究表明，基于乙醇-鹽、聚乙二醇-鹽及丙酮-鹽等體系，在黃酮、皂苷和生物堿等天然產物的分離提取中效果明顯[13-16]。另外，有研究采用β-環(huán)糊精-硫酸鈉體系應用于羅漢松枝葉揮發(fā)油的提取，其得率較水蒸氣蒸餾法提高了20.55%[17]。但雙水相萃取肉桂揮發(fā)油的相關研究還未見文獻報道。

因此，為解決揮發(fā)性成分損失、溶劑難以回收、能耗和設備造價高等問題，本文采用雙水相萃取法制備肉桂揮發(fā)油，在對其萃取體系和工藝進行優(yōu)化的基礎上，采用氣相色譜與質譜聯用對比分析雙水相萃取法和常規(guī)水蒸氣蒸餾法制得肉桂揮發(fā)油、肉桂醛得率及其風味物質差異，為香辛料精油的高效制備和應用提供理論和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉桂 北京仟草中藥飲片有限公司；肉桂醛標準品（Lot.No.924E021）、肉桂揮發(fā)油標準品（YZ-111550） 北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈色譜純；硫酸銨、硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、聚乙二醇4000、無水乙醇等其他試劑 均為分析純。

ZORBAX SB-C18色譜柱、65 μm PDMS/DVB萃取頭 艾杰科（天津）生物科技有限公司；DHC-250深冷粉碎機 江陰市弘川機械設備有限公司；ISQ 7000單四極桿GC-MS聯用儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將肉桂剪為約5 mm大小片狀，每組進料量約為500 g，采用DHC-250深冷粉碎機分別在室溫和-35 ℃溫度環(huán)境下，以30 Hz主機頻率和15 Hz風機頻率粉碎至完全出料，做3次平行實驗并取全部肉桂粉進行后續(xù)工藝優(yōu)化和提取實驗。

1.2.2 雙水相萃取肉桂揮發(fā)油

1.2.2.1 雙水相萃取工藝 采用濁點滴定法[12]繪制乙醇-鹽和聚乙二醇-鹽相圖，分別準確稱重3.00 g硫酸鈉/硫酸銨/磷酸二氫鈉/磷酸氫二鉀（ms）并溶于10.00 g的蒸餾水（mw）中，在溶液中加入乙醇直到觀察混濁，記錄乙醇的量（me）和混合物的總質量（mi）；繼續(xù)加入蒸餾水（mwj）至溶液清澈，記錄總質量（mj）。重復上述步驟，記錄足夠的數據，依據公式（1）和（2）共得到對應10組數據來建立相圖。聚乙二醇-鹽體系相圖同上。

萃取過程參考Gharat等[13-14,18-19]方法并作部分修改。第一步成相：在15 mL離心管中，分別加入定量的鹽溶液、醇溶液（w/w）至體系總重為10.00 g；第二步萃?。喊匆欢ü桃罕燃尤肴夤鸱刍靹虿嚢枰欢螘r間；第三步分相：將混勻液在4000 r/min條件下離心15 min，在室溫下量取和記錄上、下相體積并在287 nm下測定吸光值，代入揮發(fā)油標準曲線得出揮發(fā)油濃度；第四步回收：將上相萃取液旋蒸回收乙醇，得到的揮發(fā)油在4 ℃保存用于后續(xù)風味物質的分析。每組做3次平行實驗。

相比（R）和分配系數（K）計算如下：

式中：VT、VB和CT、CB為體系中上、下相的體積（mL）和揮發(fā)油濃度（10-5g/mL）。

萃取得率（ET和EB）和回收率（Y）計算如下：

多重PCR基于PCR-SSP的反應原理，在反應體系內同時加入多種引物，擴增多種目的抗原片段，減少反應次數，增大通量，既可以提高檢測效率，又能更大限度地使用個體極少見的稀有血型DNA樣本。國內報道多重PCR可在一個反應體系內同時檢測Co（a-）、Lu（b-）、Yt（a-）、Kp（b-）[15]，還可穩(wěn)定地同時檢測 Vel-，Sc1-，GIL-及 In（b-）稀有血型[16]。

式中：ET和EB分別為上相萃取率和下相萃取率；D為稀釋倍數；W為肉桂粉絕對干燥下重量，g。

1.2.2.2 標準曲線的建立 取0.10 mL濃度為1.00×10-5g/mL的肉桂揮發(fā)油標準溶液于10 mL棕色容量瓶中并用無水乙醇定容，作為儲備液。分別取0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 mL于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容制得標準溶液，在287 nm下測定吸光值。經測定，得出肉桂揮發(fā)油的標準曲線為y=1.966x+0.162 （R2=0.9943）（y為吸光值，x為揮發(fā)油濃度，10-5g/mL）。

1.2.3 雙水相萃取肉桂揮發(fā)油的工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 選用乙醇-磷酸二氫鈉體系萃取肉桂揮發(fā)油，固定條件為：固液比1:20 g/mL、乙醇濃度25%、磷酸二氫鈉濃度32%、提取時間60 min和提取溫度35 ℃，分別考查固液比（1:10、1:15、1:20、1:25和1:30 g/mL）、醇濃度（15%、20%、25%、30%和35%）、鹽濃度（28%、30%、32%、34%和36%）、提取時間（30、60、90、120和150 min）及提取溫度（25、30、35、40和45 ℃）對肉桂揮發(fā)油萃取得率的影響。

1.2.3.2 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，因提取溫度對肉桂揮發(fā)油萃取得率的影響不大而選取固液比、乙醇濃度、磷酸二氫鈉濃度和提取時間為正交試驗因素進行設計優(yōu)化，如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 肉桂揮發(fā)油含量測定 揮發(fā)油的含量測定參考中國藥典2020版[20]，先取約300 mL蒸餾水與沸石置于圓底燒瓶中，連接揮發(fā)油測定器并從上端加水至溢流入燒瓶為止，再快速加二甲苯1 mL后連接冷凝管，加熱至沸騰30 min后，停止加熱并放置約15 min，讀取二甲苯體積；再精密稱取肉桂粉40.00 g置于圓底燒瓶中，同理連接揮發(fā)油測定器并加水溢流入燒瓶為止，加熱微沸約5 h，放置1 h后讀取油層量，自油層量中減去二甲苯量即為揮發(fā)油量，重復操作3次。按以下公式計算肉桂粉中揮發(fā)油含量；

式中：V為揮發(fā)油體積，mL；W為肉桂粉絕對干燥下的重量，g。

1.2.5 肉桂醛含量測定 肉桂醛含量測定同上參考[20-21]，精密稱取肉桂粉0.50 g加入甲醇25 mL并稱重，功率350 W，頻率35 kHz條件下超聲處理10 min，放置過夜，同法超聲處理一次，稱重并用甲醇補足減失重量。量取續(xù)濾液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，用于測定肉桂醛含量。

肉桂醛測定HPLC條件：采用二元高壓梯度模式，檢測波長：290 nm；流動相為乙腈:水為35:65；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量20 μL。

肉桂醛得率公式如下：

式中：C為樣品濃度，g/mL；D為稀釋倍數；V為樣品體積，mL；W為肉桂粉絕對干燥下的重量，g。

1.2.6 肉桂揮發(fā)油風味物質分析 參考López等[22-23]頂空固相微萃取揮發(fā)性物質：先將萃取頭老化25 min，然后量取肉桂揮發(fā)油于25 mL頂空瓶，加蓋密封并在50 ℃、250 r/min條件下攪拌平衡15 min，再用已老化的萃取頭吸附25 min后在進樣口解吸15 min。GC-MS程序條件[24-25]：采用GC-MS聯用儀（離子源200 ℃，70 eV）；TG-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；爐火溫度在40 ℃保持3 min，然后以4 ℃/min的速率從40 ℃提高到150 ℃，并保持1 min；再以8 ℃/min的速率從150 ℃提高到250 ℃維持6 min；分流比為1:10；載氣：氦氣；流速：0.9 mL/min；通過使用Wiley/NBS質譜庫注冊表和NIST MS搜索并和文獻比對確定成分名稱及分類整理各風味物質相對含量。

1.3 數據處理

實驗數據均采用IBM SPSS Statistics 25和OriginPro 8.5整理分析和繪制，主成分分析采用SIMCA 14.1版軟件得到結果。

2 結果與分析

2.1 雙水相萃取體系的選擇

初步選擇有機溶劑-鹽作為萃取肉桂揮發(fā)油的雙水相萃取體系。乙醇作為綠色有機溶劑且易于萃取酚類等天然化合物，聚乙二醇4000也是藥物萃取常用的萃取介質[16]。采用濁點法繪制乙醇-硫酸鈉/硫酸銨/磷酸二氫鈉/磷酸氫二鉀和聚乙二醇4000-硫酸銨/硫酸鈉/磷酸氫二鉀體系的雙節(jié)點相圖，如圖1所示。結果表明，在低濃度范圍內，對于乙醇-鹽雙水相體系，隨鹽濃度增大，其成相能力為硫酸銨＞磷酸氫二鉀＞磷酸二氫鈉＞硫酸鈉；對于聚乙二醇4000-鹽體系，隨鹽濃度增大，其成相能力為磷酸氫二鉀＞硫酸鈉＞硫酸銨。由于鹽析作用或高聚物的不相溶性，兩種介質在水中達到一定濃度而成相，而成相能力的差異取決于兩相的濃度配比。當醇在水中的質量分數降低，其極性降低，疏水性增加，導致與水締合能力減弱，與鹽溶液的差異變大從而推動兩相的形成；當鹽在水中的質量分數提高，雙水相體系極性增大，出現的鹽析作用促使醇與鹽在水中達到配比平衡而成相[13]。為了選取最佳萃取體系，基于以上萃取體系的成相效果還需研究其對肉桂揮發(fā)油萃取的影響。

圖 1 不同雙水相體系相圖Fig.1 Phase diagrams of different aqueous two-phase systems

通過相圖選擇各體系曲線上方不同的質量濃度，考察其對肉桂揮發(fā)油的萃取效果。其中乙醇-硫酸鈉、聚乙二醇-磷酸二氫鈉體系均無分層現象，因此不能作為肉桂揮發(fā)油萃取介質。相比R和分配系數K是衡量目標物在體系中分離效果的重要指標[26]。R值和K值越大，表示目標物遷移到上相中的濃度越高，萃取效果越好。萃取體系中形成兩種不相混溶的水相間的低界面張力使得兩相之間的質量傳播增強[12]，從而不同水相間對于目標物的遷移速率具有一定的差異。如圖2所示，相比與聚乙二醇-鹽體系，乙醇-鹽體系下萃取肉桂揮發(fā)油的相比和分離系數較高，尤其乙醇-磷酸二氫鈉體系的萃取效果較好（P＜0.05）。由圖3不同雙水相體系的上、下相肉桂揮發(fā)油萃取率之比可知，乙醇-磷酸二氫鈉體系最適宜作為肉桂揮發(fā)油的萃取體系，其二者質量分數為16%/34%時的上相萃取率為2.71%（P＜0.05）。如圖4所示，乙醇-鹽體系下萃取肉桂揮發(fā)油的回收率顯著高于聚乙二醇-鹽體系，對應乙醇-磷酸二氫鈉體系的回收率高達99.79%（P＜0.05）。因此，通過優(yōu)化確定乙醇-磷酸二氫鈉體系為實驗范圍內最佳雙水相萃取體系，用于后續(xù)肉桂揮發(fā)油的提取制備實驗。

圖 2 不同肉桂揮發(fā)油萃取體系的相比和分離系數Fig.2 Comparison and separation coefficient of different cinnamon volatile oil extraction systems

圖 3 不同萃取體系下肉桂揮發(fā)油的萃取得率Fig.3 Extraction rate of volatile oil from cinnamon under different extraction systems

圖 4 不同萃取體系下肉桂揮發(fā)油的回收率Fig.4 Recovery of volatile oil from cinnamon under different extraction systems

2.2 雙水相萃取肉桂揮發(fā)油的工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗優(yōu)化結果 固液比對肉桂揮發(fā)油萃取得率的影響結果如圖5a所示。隨固液比增加，肉桂揮發(fā)油在體系中傳質空間逐漸擴大，其萃取得率逐漸增大，在固液比1:20 g/mL時達到最高值2.94%。然而隨固液比繼續(xù)增加，萃取基質的比率下降，使肉桂揮發(fā)油的表面疏水性相對降低[19]而逐漸向下相遷移，向上相的傳質速率相對減慢，從而使肉桂揮發(fā)油萃取得率呈下降趨勢。

不同乙醇濃度對肉桂揮發(fā)油的提取能力有明顯差異，結果如圖5b所示。隨乙醇濃度增加，揮發(fā)油萃取得率呈先升高后降低的趨勢，可能由于乙醇濃度的提高導致體系的粘度相對增大而處于界面電勢不穩(wěn)定的流動狀態(tài)[13]，導致揮發(fā)油的上相遷移效果不理想而影響了萃取率。當乙醇濃度為30%時，揮發(fā)油萃取得率最高達到2.52%。隨后，由于上、下相中主要物質的濃度差使得揮發(fā)油向下相分布，同時可能還提取了更多的黃酮類化合物使其萃取得率降低[16,27]，從而導致萃取得率呈下降趨勢。

圖5c為雙水相萃取體系中磷酸二氫鈉濃度對肉桂揮發(fā)油萃取得率影響的結果。隨著鹽濃度提高，肉桂揮發(fā)油萃取得率明顯提高并在鹽濃度34%時最高。此后繼續(xù)提高鹽濃度，萃取得率呈現下降趨勢，說明體系中醇和鹽的濃度比例變化而導致目標物向下相部分遷移[28]。

由圖5d可知，萃取時間對肉桂揮發(fā)油萃取得率的影響顯著。隨著萃取時間延長，揮發(fā)油萃取得率先上升后下降，當提取時間為60 min時，萃取得率達到最大值。提取時間的適當延長有助于形成雙水相體系的動態(tài)平衡[18]，但是過長時間的萃取可能打破體系的平衡狀態(tài)，使上相中目標物質濃度過高而向下相中轉移從而導致萃取得率降低。

萃取溫度對肉桂揮發(fā)油萃取得率的影響結果如圖5e所示。在常溫25 ℃下萃取效果最差。隨溫度升高，加快了萃取體系中醛類、烯類等大分子及其他小分子的遷移速率，促使目標物更多地遷移到上相中。當萃取溫度在35 ℃時，揮發(fā)油萃取得率達到最高。由于30～45 ℃萃取溫度下萃取得率變化不大，故下述正交實驗未考慮納入萃取溫度。

圖 5 雙水相萃取肉桂揮發(fā)油單因素優(yōu)化Fig.5 Aqueous two-phase extraction of cinnamon volatile oil with single factor optimization

2.2.2 正交試驗優(yōu)化結果 由表2可知，雙水相提取工藝因素對肉桂揮發(fā)油萃取得率影響程度：B（磷酸二氫鈉濃度）＞A（乙醇濃度）＞D（萃取時間）＞C（固液比），優(yōu)化提取工藝為A1B2C1D2，即乙醇濃度為25%，磷酸二氫鈉濃度為34%，固液比為1:15 g/mL；提取時間為60 min。方差分析結果顯示，優(yōu)化因素中雙水相萃取體系組成濃度和提取時間對肉桂揮發(fā)油的萃取得率影響顯著。經驗證得到揮發(fā)油平均萃取得率為2.71%±0.10%，與正交試驗結果基本一致。

表2 正交試驗結果及方差分析Table 2 Orthogonal experiment results and variance analysis

2.3 雙水相萃取對肉桂揮發(fā)油和肉桂醛得率的影響

采用乙醇-磷酸二氫鈉雙水相體系在最佳工藝下提取肉桂揮發(fā)油和肉桂醛得率如圖6所示。與傳統水蒸氣蒸餾法相比，采用雙水相萃取肉桂揮發(fā)油和肉桂醛得率分別提高了1.07和1.31倍。其中，揮發(fā)油得率略高于Pistelli等[29]、孫鳳蕊[30]文獻報道采用超聲輔助蒸餾提取肉桂揮發(fā)油得率（2.63%～4.64%）?；谝掖?磷酸二氫鈉體系的雙水相萃取法比超聲輔助方式耗能低并有效節(jié)省提取時間，且兩相界面張力引起分子快速遷移的萃取環(huán)境更易分離和保留熱敏性物質，因而在肉桂揮發(fā)油提取和分離上具有一定優(yōu)勢。

圖 6 不同方法萃取肉桂揮發(fā)油、肉桂醛得率的變化Fig.6 Changes in the yields of cinnamon volatile oil and cinnamaldehyde extracted by different methods

2.4 雙水相萃取對肉桂揮發(fā)油風味的影響

雙水相萃取與水蒸氣蒸餾提取肉桂揮發(fā)油風味物質的相對含量如表3所示。采用GC-MS檢測到兩種提取方法獲得肉桂揮發(fā)油主要風味物質分別有14和15種，以萜烯類和醛類為主。與文獻報道[16,25]相比，所測得烯類含量較高，這可能與肉桂原料品種和采收批次等有關。結果表明，與水蒸氣蒸餾法相比，雙水相萃取得到肉桂揮發(fā)油中含有較高的（-）-α-蒎烯、衣蘭烯、（+）-環(huán)苜蓿烯、杜松萜-1（10）,4-二烯、α-衣蘭油烯等單萜、倍半萜類物質。這可能由于這類烯萜物質是肉桂揮發(fā)油中主要的揮發(fā)性物質，易溶于醇及親脂性溶劑，使其在乙醇-磷酸二氫鈉體系中的分配系數增大而利于向上相聚集[16]。其中，雙水相萃取獲得肉桂揮發(fā)油中（-）-α-蒎烯的相對含量占59.93%，與傳統方法相比提高了1.03倍，其用途十分廣泛，主要用于制取香水、合成香料、潤滑劑、增塑劑等的起始原料[31]。盡管雙水相萃取肉桂中肉桂醛提取得率高于水蒸氣蒸餾，但是其在揮發(fā)油中的相對含量與傳統方法相比略有降低。因此，采用乙醇-磷酸二氫鈉雙水相體系萃取肉桂揮發(fā)油在風味組成上有利于萜烯類揮發(fā)性物質的提取。

表3 不同萃取方式肉桂揮發(fā)油風味物質相對含量Table 3 Content of flavor compounds in volatile oil of cinnamon by different extraction methods

雙水相萃取和水蒸氣蒸餾提取肉桂揮發(fā)油風味物質的主成分分析對比結果如圖7所示。主成分分析中R2X（cum）代表在當前主成分數量時解釋方差的累積值，而Q2（cum）指的是隨著主成分數量增加時該模型的預測能力。如圖7a～圖7b所示，通過主成分分析共提取到了兩個主成分，共占到總物質的85.8%（R2X（cum））且Q2（cum）均大于0.5，說明該模型可以較好地分析肉桂揮發(fā)油的整體風味。如圖7b所示，雙水相萃取和水蒸氣蒸餾樣本組之間呈現明顯分離，表明兩種提取方法對肉桂揮發(fā)油風味物質組成有明顯差異。由圖7c可知，對第一主成分貢獻較大的是反式肉桂醛、β-欖香烯、α-紫穗槐烯和佛術烯，具有辛辣、辛香風味[32-33]。這些物質與水蒸氣蒸餾樣本組呈正相關，即為水蒸氣蒸餾法得到肉桂揮發(fā)油中的主要特征風味。對第二主成分貢獻較大的是（+）-環(huán)苜蓿烯、（+）-苜蓿烯、β-石竹烯和4,7-二甲基-1-丙基-1,2,3,4,5,6-六氫萘，具有丁香、松脂氣味[32-33]。雙水相萃取法得到的肉桂揮發(fā)油中以（+）-環(huán)苜蓿烯、（-）-α-蒎烯、4,7-二甲基-1-丙基-1,2,3,4,5,6-六氫萘、衣蘭烯、杜松萜-1（10）,4-二烯及α-衣蘭油烯等為主要特征成分。這進一步表明了雙水相萃取制得肉桂揮發(fā)油與水蒸氣蒸餾法相比具有多種萜烯類的風味特征。

圖 7 不同萃取方式肉桂揮發(fā)油風味物質的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of volatile oil from cinnamon by different extraction methods

3 結論

通過單因素和正交實驗優(yōu)化得出雙水相萃取肉桂揮發(fā)油最佳工藝為：乙醇質量分數25%，磷酸二氫鈉質量分數34%，固液比1:15 g/mL，萃取時間60 min，萃取溫度35 ℃，此條件下肉桂揮發(fā)油和肉桂醛得率為2.82%和0.037%，與常規(guī)水蒸氣蒸餾法相比分別提高了1.07和1.31倍。采用GC-MS檢測分析出肉桂揮發(fā)油風味物質以萜烯類和醛類為主。通過主成分分析法對雙水相萃取法和水蒸氣蒸餾法制得揮發(fā)油組成進行差異分析，二者主要特征成分存在顯著差異，雙水相萃取法制得肉桂揮發(fā)油含有更多的α-蒎烯、衣蘭烯和環(huán)苜蓿烯等萜烯類成分。結果表明，雙水相萃取肉桂揮發(fā)油具有條件溫和、得率高、萜烯類成分豐富的優(yōu)勢，為肉桂揮發(fā)油的高效制取和利用提供理論支撐，但對于雙水相體系的微觀界面特性等相關揮發(fā)油萃取機理有待深入探究。