高詩薇，朱禹蒙，王齊蕾，曹 倩，王承健，呂新剛

（西北大學食品科學與工程學院，陜西西安 710069）

隨著社會經濟的發(fā)展，人們對飲食健康愈發(fā)重視，一些高營養(yǎng)價值的食品成為消費者的首選。十字花科蔬菜含有豐富的維生素、膳食纖維、硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GLs）等重要活性物質，具有很高的營養(yǎng)價值[1-2]。西蘭花（Brassica oleraceaL.var.italic Planch），是十字花科蕓薹屬一年生植物，其被稱為天然抗氧化蔬菜。研究表明，西蘭花有助于預防多種癌癥疾病的發(fā)生[3]。這主要歸因于西蘭花中含有豐富的硫苷，其在黑芥子酶的作用下形成的水解產物異硫氰酸酯（Isothiocyanate，ITCs）具有顯著的抗癌活性[4]。蘿卜硫素（Sulforaphane，SF）被證實是異硫氰酸酯中最有效的活性物質之一[5]。西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量是西蘭花的幾十倍，是蘿卜硫素良好來源，但由于西蘭花種子價格高，特別的種子中蘿卜硫素含量越高，其價格也越高，由此導致獲取成本居高不下。因此，低成本實現西蘭花芽苗中蘿卜硫素的富集，降低蘿卜硫素的獲取成本，對提升西蘭花芽苗在疾病預防中的作用具有重要意義。

圖 1 等離子體裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasma device

研究表明，外源化學或物理方法處理可誘導西蘭花芽苗中蘿卜硫素的積累。初婷等[6]外源噴灑MgSO4處理芽苗可顯著提高蘿卜硫素含量，較對照組增加了68.2%；利用熱激處理西蘭花芽苗提取蘿卜硫素，7d熱激脅迫下西蘭花芽苗中蘿卜硫素的形成量是對照的2.54倍[6]；韓宇等[7]研究經高溫聯合噴施ZnSO4及Na2SeO3處理芽苗可提高蘿卜硫素含量，較單獨噴施ZnSO4處理增加了39%；Selcuk等[8]對西蘭花芽苗菜的研究表明，UV-B可誘導硫代葡萄糖苷的合成，在UV-B輻射24 h下除促進山奈酚和槲皮素的積累還可促進蘿卜硫素含量。

等離子體處理是近年來迅速發(fā)展起來的用于種子萌發(fā)的新型加工技術。等離子體環(huán)境是一個具有光、電、磁及活性粒子的綜合環(huán)境。經該綜合環(huán)境中的某個因素或多綜合因素處理后的植物種子，多方面的性質如萌發(fā)活力、發(fā)芽率、活性物質含量、抗脅迫能力等都會發(fā)生改變[6-9]。Saengha等研究芥菜種子經等離子體處理后，單位重量芽苗中總異硫氰酸酯含量增加了3.5倍，總酚增加了1.7倍，總類黃酮增加了近30倍，抗氧化活性顯著增強[10]。Kim等研究等離子體處理對西蘭花種子發(fā)芽率和理化性質，檢測到等離子體能顯著提高西蘭花種子的發(fā)芽率和幼苗生長，而不影響其相應產品的理化和感官特性[11]。等離子體用于種子萌發(fā)處理，具有處理時間短、能耗低、操作方便、效果顯著的特點，應用前景廣闊。

等離子體處理如何影響西蘭花芽苗中生物活性物質含量目前仍缺乏系統研究。本研究首先研究不同等離子體處理條件對西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量影響，其次明確等離子體處理對不同品種西蘭花芽苗中總硫苷、蘿卜硫素、多酚等生物活性物質含量變化的影響，來為低成本獲取富含蘿卜硫素的西蘭花芽苗產品提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花種子：品種文興（WX）、馬尼拉（MNL）、曼陀綠（MTL）、綠寶石（LBS）、綠玉（LY）、綠劍（LJ）種子 廈門市文興蔬菜種苗有限公司；生化試劑：98%黑芥子硫苷酸鉀標準品 美國Sigma公司；甲醇（色譜純） 上海陸都化學試劑廠；草酸、97.5%沒食子酸標準品、98%蘆丁標準品、福林酚 上海化學試劑有限公司；甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、鹽酸（分析純）、磷酸（分析純） 天津市天力化學試劑有限公司。

等離子體裝置 南京蘇曼等離子科技有限公司；智能恒溫光照培養(yǎng)箱 山東恒美電子科技有限公司； LC-2030C 3D Plus型液相色譜質譜聯用儀 日本島津制作所；UV1800分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；UV-7504C型紫外可見分光光度計上海欣茂儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司；DICO型臺式離心機

Thermo Fisher有限公司；BSA224S型電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FD-1C-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海佑科儀器有限公司；52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 等離子體處理西蘭花種子 圖1為實驗室用等離子體機裝置簡單示意圖，由等離子體發(fā)生器產生的高頻交流信號經高壓電纜線輸入至包覆于扁口狀石英管（管口規(guī)格為50 mm×5 mm）外的鋁箔高壓電極；在距離鋁箔下邊緣3 mm處放置一個單側鍍金屬膜的石英介質板，金屬膜的一側向下放置充當低壓電極與大地相連，從而形成完整的電回路；等離子體射流經發(fā)生器噴向石英管開口附近區(qū)域[12]。將每100粒待處理西蘭花種子置于石英板上的等離子體射流區(qū)域進行處理，控制其對應電壓值與時間。根據預實驗結果，本研究中電壓設置為25和30 V，處理時間設置為1、2和3 min。

1.2.2 西蘭花芽苗的培養(yǎng) 將等離子體處理后和未處理西蘭花種子用2%次氯酸鈉消毒后，用蒸餾水洗至中性，于室溫條件下浸泡8 h；將浸泡后的種子均勻的鋪在發(fā)芽盤，將發(fā)芽盤整齊擺放于發(fā)芽箱中，在25 ℃條件下發(fā)芽（16 h光照，8 h黑暗）。每日4次噴固定量的蒸餾水，發(fā)芽至5 d收集芽苗，吸干水分后液氮冷凍，置于-80℃保存。

1.2.3 指標測定方法

1.2.3.1 芽苗發(fā)芽率 收集芽苗時記錄發(fā)芽株數，按照公式（1）計算發(fā)芽率。

1.2.3.2 芽苗菜芽長與鮮質量的測定 將每組處理的西蘭花芽苗都隨機抽取50根芽苗為一個樣本，用游標卡尺測量其長度。擦干表面水分并于精密電子天平稱其質量，計算單株芽苗的質量。

1.2.4 蘿卜硫素（SF）含量的測定 參照Lü等[13]的方法并修改，采用粉碎機粉碎液氮處理后的西蘭花芽苗，取芽苗粉末1 g加入少量蒸餾水，置于55 ℃的水浴鍋中漂燙15 min，迅速冷卻，在瓷臼中研磨至勻漿，然后與pH4.0的磷酸鹽緩沖液混合到一定的料液比5:1，添加抗壞血酸0.15 mg，將樣品置于37℃的恒溫振蕩器中，酶解5.5 h。在酶解過程中，每隔30 min，37 ℃超聲5 min。酶解結束后，冷凍干燥，加入5 mL丙酮30 ℃超聲浸提30 min，離心（9000 r/min 10 min），收集上清液，殘渣重復浸提。將合并的上清液30 ℃條件下旋轉蒸發(fā)濃縮，甲醇溶解殘留物質定容至3 mL，經0.45 μm有機濾膜過濾，收集濾液進HPLC測定含量，其含量由標準方程y=2E+07x+31972，R2=0.9998計算。HPLC條件：色譜柱：SB-C18色譜柱；檢測波長：195 nm；流速：1 mL/ min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：水:甲醇=72%:28%。結果用mg/g DW表示。

1.2.5 蘿卜硫苷（GLs）含量的測定 參照李寧等[14]的方法并作修改。精確稱取西蘭花芽苗粉末0.5 g，以料液比1:6 g/mL加入超純水3 mL，超聲30 min，在10000 r/min條件下離心20 min后取上清液重復3次，用超純水定容至5 mL，Sevag去蛋白后，在10000 r/min條件下離心20 min，過聚醚砜微孔濾膜，進HPLC檢測，其含量由標準方程y=2E+07x-406176，R2=0.9992計算。HPLC條件：色譜柱：SB-C18色譜柱；檢測波長：234 nm；流速：0.6 mL/ min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液:甲醇=95%:5%。計算每克種子中GLs含量，結果用mg/g DW表示。

1.2.6 總酚（TP）含量的測定 參照Lü[13]等的方法并修改。稱取西蘭花芽苗0.5 g，加入50%甲醇研磨勻漿后離心；取上清液1 mL，加入1 mL福林-酚試劑、2 mL 20 g/L Na2CO3，暗處反應2 h，于765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸作標準曲線，由標準方程y=19.17x+0.0485，R2=0.9954計算，結果以mg RE/g表示。

1.2.7 總黃酮（TF）含量的測定 參照Lü等[13]的方法并修改。稱取0.5 g西蘭花芽苗，加入50%甲醇研磨勻漿后離心；準確移取1 mL上清液，加入1 mL 5%NaNO2溶液，孵育6 min，再加入1 mL 10%Al（NO3）3，6 min后加入10 mL 4% NaOH， 混勻，15 min后，于510 nm處測定其吸光度，其含量由標準方程y=0.8939x+0.0163，R2=0.9953計算，結果以每克種子或芽苗中含有相當蘆丁的亳克數表示，單位為mg RE/g。

1.2.8 DPPH自由基清除率的測定 參考Lü等[13]描述的方法，準確移取適當稀釋后的樣品溶液1 mL加入3 mL 0.1mmol/L DPPH溶液，混和均勻避光反應1 h于517 nm下測定溶液的吸光度無水乙醇作為參比。對照組（Acontrol）由1 mL甲醇和3 mL DPPH溶液組成，空白組（Ablank）由1 mL樣品和3 mL甲醇組成。

以抗壞血酸作標準曲線，計算DPPH自由基清除能力，結果表示為mg TEAC/g 。

1.2.9 鐵還原抗氧化能力（FRAP）的測定 參考Lü等[13]描述的方法進行測定。

FRAP工作液：0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.6），0.02 mol/L FeCl3，0.01 mol/L TPTZ鹽酸溶液（0.04 mol/L HCL）按照10:1:1的體積比混合，此工作液現用現配。

準確移取上清液400 μL加入3.6 mL FRAP工作液，混勻，37 ℃反應10 min后，于593 nm處測定其吸光度值。以FeSO4作標準曲線，求回歸方程，計算樣品的 FRAP值結果用mg Fe2+/g表示。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同等離子體處理條件對西蘭花芽苗發(fā)芽情況及SF含量影響

2.1.1 不同等離子體處理條件對西蘭花芽苗形態(tài)特征及發(fā)芽情況 圖2為西蘭花芽苗生長形態(tài)圖，從圖中看出不同等離子處理條件對西蘭花芽苗生長狀態(tài)均受到影響。相較于對照，經等離子體處理后，西蘭花芽苗芽長均有所增長。

本實驗處理使用文興（WX）品種，保持等離子體處理電壓為30 kV，處理時間不同對西蘭花芽苗影響。表1結果表明，等離子體處理組發(fā)芽率相較對照無顯著差異（P＞0.05）。經等離子體處理后，發(fā)芽3和5 d的芽長均高于對照，尤其是經等離子體處理2 min，芽長分別增加36.5%和32.1%，但無統計學差異（P＞0.05）。隨等離子體處理時間延長，芽重呈先增加后降低趨勢，在處理2 min時芽重數值最大，顯著高于對照與其他處理組（P＜0.05）。

表1 不同等離子體處理條件對西蘭花芽苗影響Table 1 Effects of different plasma treatment conditions on broccoli sprouts

2.1.2 不同等離子體處理條件對西蘭花芽苗SF含量影響 圖3可知，等離子體處理條件不同造成西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量呈現出較大地差異性。相較于對照組，25和30 kV等離子體處理的西蘭花芽苗中蘿卜硫素最大含量分別提高了5.32倍和6.75倍。不同電壓下，處理時長對蘿卜硫素含量影響存在差異。25 kV下，等離子體處理1和2 min時，各處理時間無顯著差異，3 min處理較1～2 min時長處理降低約15%～20%；30 kV下，隨處理時間延長，蘿卜硫素含量呈先增加后降低趨勢，在2 min時達到最大值，且較其他時間高50%以上?？傮w上，30 kV 2 min處理后的芽苗中蘿卜硫素含量增加程度最高，達到3.24 mg/g DW。

圖 2 不同等離子體處理條件對西蘭花芽苗形態(tài)表征的影響Fig.2 Effects of different plasma treatment conditions on morphological characterization of broccoli sprouts

圖 3 等離子處理電壓和時間對西蘭花芽苗SF含量影響Fig.3 Effects of plasma treatment voltage and time on the Sulforaphane content of broccoli sprouts

2.2 等離子體處理對不同品種西蘭花芽苗發(fā)芽情況及活性物質含量的影響

選取最優(yōu)等離子處理條件電壓為30 V，時間為2 min測定不同品種西蘭花芽苗生物活性指標。由表2可知，等離子體處理與對照處理不同品種西蘭花芽苗發(fā)芽率、芽長和芽重呈現出不同的差異性。6個品種相比較，MTL發(fā)芽率最高，可達87.8%。LBS未經等離子體處理，芽長可達9.06 cm，芽重可達0.042 g。而等離子體處理2 min不同品種西蘭花芽苗芽長無顯著差異（P＞0.05），但等離子體處理2 min不同品種西蘭花芽苗與對照處理相比，芽長芽重均有所提高。WX經等離子體處理2 min后，較對照相比芽長增加了24.6%；芽重增加了26.7%。

表2 等離子體處理對不同品種西蘭花芽苗影響Table 2 Effects of plasma treatment on sprouts of different varieties of broccoli

由圖4可知，本研究中選取的6個品種的西蘭花芽苗中的蘿卜硫素和總硫苷含量有較大差異。其中MNL的蘿卜硫素和總硫苷含量均顯著高于其他5個品種（P＜0.05）。圖4（A）表明，等離子體處理后，六個品種SF含量均顯著提升，較未處理提高了17～85%，平均提高40.8%。圖4（B）表明，等離子體處理后WX、MNL和LY品種芽苗總硫苷含量較對照處理均顯著提高（P＜0.05），較未處理分別提高了27%、19%和41%；但MTL、LJ和LBS芽苗中的總硫苷含量較對照無顯著差異（P＞0.05）。

由圖5可以看出，MTL和LY品種總酚和總黃酮含量顯著高于其他品種（P＜0.05），其他品種間無顯著差異（P＞0.05）。WX、MNL、LY和LBS經等離子體處理后總酚和總黃酮含量均有所提高，但除了MNL的總黃酮含量外，等離子體處理對其他三個品種總酚和總黃酮含量影響并無統計學差異。MTL和LJ兩個品種經等離子體處理后總酚和總黃酮含量顯著降低（P＜0.05）。

由圖6A可以看出，經等離子體處理后，WX和MNL的清除DPPH自由基能力較對照分別升高了28.4%和24.7%；圖6B表明，MNL的Fe2+還原能力對照升高了14.4%（P＜0.05）；但等離子體處理也導致了MTL和LJ兩個品種Fe2+還原能力的降低。其他品種經等離子體處理后清除DPPH自由基能力和Fe2+還原能力與對照無顯著差異（P＞0.05）。

圖 4 等離子體處理對不同品種西蘭花芽苗SF（A）和GLs（B）含量影響Fig.4 Effects of plasma treatment on sulforaphane (A) and glucosinolates (B) content of different varieties of broccoli sprouts

圖 5 等離子體處理對不同品種西蘭花芽苗TP（A）和TF（B）含量影響Fig.5 Effects of plasma treatment on total phenols (a) and total flavonoids (b) content of different varieties of broccoli sprouts

圖 6 等離子體處理對不同品種西蘭花芽苗抗氧化指標的影響Fig.6 Effects of plasma treatment on the antioxidant indexes of different broccoli sprouts

3 討論

等離子體是一個復雜的物理態(tài)，其處理可能對種子產生積極和消極的影響。等離子體對種子萌發(fā)的影響因素被證實的主要是刻蝕作用[15]，不同種子的敏感度不同，不同的處理條件也會出現不一樣的效果[16]。在合適的電壓和處理時間內對西蘭花種子進行處理能有效地改善其種子萌發(fā)、生長發(fā)育的速度。WX在被處理后，其發(fā)芽率相較未處理有增有減。等離子體處理時間為2 min時，發(fā)芽率、芽長和芽重均為最高值。Kim等[11]研究等離子體處理種子1或2 min對芽苗的重量和長度有積極影響。當等離子體處理條件適當，經過處理后，種子的通透性得到提高，也會增加其親水性而改善生根且處理后增強了其吸漲作用，種子會很快從外界獲取營養(yǎng)[17]。所以確定適當的等離子體處理參數，對種子的生物活性物質含量影響起著關鍵性作用。西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量隨等離子體處理時間增大而先升高后降低，主要是因為當種子遭受一定的脅迫，蘿卜硫素作為植物中重要的次生代謝產物，其含量會得到積累；但是當脅迫作用到一定程度后，次生代謝產物含量不會繼續(xù)增加[18-19]。30 kV 2 min等離子體處理后蘿卜硫素含量提高了6.75倍，達到3.24 mg/g DW。這可能是由于低溫等離子體的照射激活了種子中與蘿卜硫素合成相關的酶的活性，例如支鏈氨基酸轉移酶和細胞色素P450氧化酶活性[20]，從而顯著增加蘿卜硫素的含量，且等離子體處理能夠加速種子體內蛋白酶的轉化，激活種子的生命力，這也有助于增加蘿卜硫素的富集量[10-11]。

不同品種的種子經等離子體處理后，會表現出不同的敏感度[21]。等離子體對某些種子具有一定的脅迫作用，MNL和LY經等離子體處理后抑制了種子萌發(fā)和生長發(fā)育。等離子體處理不同品種西蘭花種子，蘿卜硫素含量較對照處理均顯著提高（P＜0.05），但MTL、LJ兩個品種的硫苷含量顯著低于對照處理（P＞0.05），其原因可能是MTL和LJ中黑芥子酶活性較高，抑制了蘿卜硫苷向蘿卜硫素的轉化或經等離子體處理后加快了ESP蛋白的失活，抑制了蘿卜硫苷向蘿卜硫腈的轉化，從而提高蘿卜硫素含量。Guo[1]等人研究也表明，不同品種西蘭花的蘿卜硫素和總硫苷含量也存在差異, 研究了10個品種的西蘭花種子中蘿卜硫素與總硫苷含量為0.12～11.37 mg/g DW和7.11～134.06 μmol/g DW。

總酚與總黃酮是西蘭花芽苗菜中重要的抗氧化物質,不同品種間抗氧化物質含量經過等離子體處理后存在差異性，WX、MNL、LY和LBS經等離子體處理后抗氧化物質顯著升高（P＜0.05），這可能是由于等離子體處理改變了不同種基因型產生抗氧化物質的能力和接受環(huán)境能力[22-24]。且本研究中WX、MNL、LY和LBS經等離子體處理后清除DPPH自由基能力和Fe2+還原抗氧化能力也顯著升高（P＜0.05）。據報道，芽苗中的茉莉酸甲酯能顯著增加總酚類含量，從而能提高DPPH的自由基清除能力[25-26]。與Kim等[27]研究結果一致：1 mmol/L外源茉莉酸甲酯處理蘿卜芽苗TPC含量相比對照提高41%，且清除DPPH自由基能力顯著提高。而MTL與LJ的總酚、總黃酮含量、清除DPPH自由基能力和Fe2+還原抗氧化能力經等離子體處理與對照相比顯著降低（P＞0.05），表明等離子體處理對西蘭花芽苗菜也可能造成一定的脅迫效應，總酚、總黃酮含量的增加與抗氧化能力的增加之間也存在類似的相關性[27],使酚類物質得到積累以抵御脅迫[28-30]。

4 結論

西蘭花芽苗經等離子體處理后，其生長發(fā)育狀態(tài)和活性物質含量受到顯著影響。等離子體處理電壓、時間對西蘭花芽苗發(fā)芽狀態(tài)及活性物質含量都有顯著影響，在電壓30 kV，處理時間2 min條件下，西蘭花芽苗發(fā)芽5 d后芽長、芽重都有顯著增加，蘿卜硫素含量最高達到3.24 mg/g DW，較未處理提高了6.75倍。不同品種西蘭花芽苗中蘿卜硫素、總酚、總黃酮含量及抗氧化活性存在顯著差異，其中MNL的蘿卜硫素和總硫苷含量最高，而MTL和LY的總酚和總黃酮含量最高。等離子體處理WX、MNL、LY和LJ的總酚和總黃酮含量及抗氧化能力較對照處理均有所提高。這些結果表明等離子體處理可實現西蘭花芽苗中蘿卜硫素等活性物質的富集，提高其生物學功效，降低蘿卜硫素等獲取成本，在食品工業(yè)中顯現出了極大的應用潛力。