楊麗亞 劉彩玉

蘿卜硫素(sulforaphane)又稱“萊菔子素”，屬于異硫代氰酸鹽衍生物，廣泛存在于西蘭花、花椰菜、甘藍(lán)、蘿卜及芥菜等十字花科植物。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥及參與免疫調(diào)節(jié)等方面的功效[1-4]。對(duì)胃癌、結(jié)腸癌及肺癌等都有著較好的藥理活性[5-7]；腫瘤的發(fā)生發(fā)展與環(huán)氧化酶-2(COX-2)的高表達(dá)密切相關(guān)，人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中COX-2表達(dá)呈明顯升高的趨勢(shì)[8]。早期研究還提出COX-2的高表達(dá)還能誘導(dǎo)Akt/GSK3β信號(hào)傳導(dǎo)[9]，并且后者還參與人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移等生物學(xué)過程[10]。然而，目前關(guān)于蘿卜硫素是否通過調(diào)節(jié)Cox-2/Akt/GSK3β信號(hào)通路活化，進(jìn)而抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖的研究甚少。因此，本研究旨在觀察蘿卜硫素對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖及凋亡的影響，及蘿卜硫素對(duì)Cox-2/Akt/GSK3β信號(hào)通路的影響。

1 材料及方法

1.1 主要材料 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株購(gòu)自武漢巴菲爾生物有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；CCK8試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；RIPA裂解液購(gòu)自杭州四季青公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)；Annexin V/FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物公司；兔抗鼠Survivin、Casepase-3、Cox-2、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β及β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；羊抗兔IgG二抗購(gòu)自上海谷歌生物公司；ELC化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Advansta公司。

1.2 主要儀器 BIORAD-550型酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司)；Amersham Imager 600儀器(BIO-RAD，美國(guó))；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.3 A431細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A431細(xì)胞，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃恒溫。待細(xì)胞融合至90%左右，便進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體操作步驟如下：PBS清洗細(xì)胞2遍，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至無菌Ep管中，1000 r/min離心5 min，棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種至96孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度蘿卜硫素(0、30、60、120 μM)、順鉑(3 μM)及順鉑+蘿卜硫素(30、60、120 μM)處理細(xì)胞24 h。除去舊培養(yǎng)液，每孔加入20 μL CCK8試劑，放于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的細(xì)胞吸光度A值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種至6孔板，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度蘿卜硫素(0、30、60、120 μM)、順鉑(3 μM)及順鉑+60 μM蘿卜硫素處理細(xì)胞24 h。消化、離心、收集細(xì)胞，PBS清洗2次，離心后加入1×binding buffer制成細(xì)胞懸液，置于流式管，加Annexin V-FITC與PI 各5 μL，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 按照“1.5”項(xiàng)操作進(jìn)行藥物干預(yù)，收集細(xì)胞冰上充分裂解30 min，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，每孔上樣50 μg進(jìn)行凝膠電泳(恒壓70 V，3 h)，待蛋白完全分離后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)(恒流275 mA，70 min)，5%脫脂牛奶封閉蛋白條帶1 h后，孵育一抗(Survivin、Casepase-3、Cox-2、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β及β-actin，稀釋比1∶1000)，4℃過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育二抗90 min(稀釋比1∶3000)，TBST洗膜3次，ECL顯色，暗室曝光。蛋白灰度值采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 CCK8法測(cè)定蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞相對(duì)存活率的影響 低劑量(30 μM)蘿卜硫素組A431細(xì)胞吸光度A值與對(duì)照組相比沒有明顯差異(P>0.05)，其余蘿卜硫素組、順鉑組及順鉑+蘿卜硫素組的A值均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。順鉑+蘿卜硫素組的A值均顯著低于單純順鉑組(P<0.05)；順鉑+蘿卜硫素組的A值均顯著低于同劑量蘿卜硫素組(P<0.05)，見表1。

表1 不同組間A431細(xì)胞相對(duì)存活率比較

注：與對(duì)照組比較，1：P<0.05；與順鉑組比較，2：P<0.05；順鉑+蘿卜硫素組與同劑量蘿卜硫素組比較，3：P<0.05

2.2 蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞凋亡率的影響 A431細(xì)胞凋亡率主要體現(xiàn)在早期凋亡(見圖2中右下象限)，對(duì)照組A431細(xì)胞凋亡率為(0.74±0.13)%，低、中、高劑量蘿卜硫素組A431細(xì)胞凋亡率分別為(1.31±0.15)%、(2.72±0.0.19)%、(3.86±0.34)%，單純順鉑組凋亡率為(5.46±0.49)%，順鉑+中劑量蘿卜硫素組凋亡率為(7.95±0.61)%；不同劑量蘿卜硫素組、單純順鉑組及順鉑+中劑量蘿卜硫素組A431細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；隨著蘿卜硫素濃度的升高，細(xì)胞凋亡率也隨之增高；順鉑+中劑量蘿卜硫素組的早期凋亡率顯著高于不同劑量蘿卜硫素組(P<0.05)。

圖1各組間A431細(xì)胞凋亡率的比較

2.3 蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞中Survivin和Casepase-3蛋白表達(dá)的影響 蘿卜硫素對(duì)Survivin和Casepase-3蛋白表達(dá)的影響見表2、圖2。各蘿卜硫素組、順鉑組及順鉑+蘿卜硫素組中Survivin表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，Caspase-3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；隨著蘿卜硫素劑量的增高，Survivin表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3表達(dá)水平顯著升高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；單純順鉑組Survivin表達(dá)量顯著低于各蘿卜硫素組，Caspase-3表達(dá)顯著高于各蘿卜硫素組(P<0.05)；順鉑+蘿卜硫素組的Survivin表達(dá)顯著高于各蘿卜硫素和單純順鉑組(P<0.05)。

表2 各組間Survivin和Casepase-3蛋白表達(dá)水平的比較

注：與對(duì)照組比較，1：P<0.05；與順鉑組比較，2：P<0.05；順鉑+蘿卜硫素組與同劑量蘿卜硫素組比較，3：P<0.05。

注：1：對(duì)照組，2：低劑量蘿卜硫素組，3：中劑量蘿卜硫素組，4：高劑量蘿卜硫素組，5：?jiǎn)渭冺樸K組，6：順鉑+中劑量蘿卜硫素組。

圖2蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞中Survivin和Casepase-3蛋白表達(dá)的影響

2.4 蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞中Cox-2/Akt/GSK3β信號(hào)通路的影響 蘿卜硫素對(duì)Cox-2/Akt/GSK3β信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響見表3、圖3。各蘿卜硫素組、順鉑組及順鉑+蘿卜硫素組中Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達(dá)水平相比于對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)；隨著蘿卜硫素劑量的增高，Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達(dá)水平顯著降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；單純順鉑組Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達(dá)量顯著低于各蘿卜硫素組(P<0.05)；順鉑+蘿卜硫素組的Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達(dá)顯著低于各蘿卜硫素和單純順鉑組(P<0.05)。

表3 各組間Cox-2/Akt/GSK3β信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的比較

注：與對(duì)照組比較，1：P<0.05；與順鉑組比較，2：P<0.05；順鉑+蘿卜硫素組與同劑量蘿卜硫素組比較，3：P<0.05

注：1：對(duì)照組，2：低劑量蘿卜硫素組，3：中劑量蘿卜硫素組，4：高劑量蘿卜硫素組，5：?jiǎn)渭冺樸K組，6：順鉑+中劑量蘿卜硫素組。

圖3蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞中Cox-2/Akt/GSK3β信號(hào)通路的影響

3 討論

蘿卜硫素來源于十字花科植物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[5-7]。除此之外，蘿卜硫素對(duì)多種皮膚性疾病有著較好的藥理作用[11,12]，而對(duì)于人皮膚鱗狀細(xì)胞癌的輔助治療是否具有潛在價(jià)值，需進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞為體外研究模型，觀察了蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并初步探討了其作用機(jī)制。腫瘤發(fā)病機(jī)制不僅與癌細(xì)胞增殖、分化異常相關(guān)，還與細(xì)胞凋亡受阻有關(guān)。因此，阻滯腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡可能是防治癌癥的主要手段[13]。已有研究證實(shí)，蘿卜硫素可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞DNA合成、提升機(jī)體細(xì)胞免疫力等方面起著抗腫瘤的功效[14]。

細(xì)胞凋亡由基因調(diào)控的細(xì)胞自主程序性死亡，多種基因活化可調(diào)節(jié)此生物學(xué)效應(yīng)。凋亡途徑包含死亡受體途徑及線粒體途徑，它們均能引起效應(yīng)性Caspase-3活化，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)切核酸酶激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[15,16]。Caspase是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要蛋白，而Survivin蛋白屬于抑制凋亡蛋白，主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7活性阻斷細(xì)胞凋亡，并且上述蛋白表達(dá)水平與人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、凋亡相關(guān)密切[17,18]。

以A431細(xì)胞增殖、凋亡為切入點(diǎn)，進(jìn)一步觀察蘿卜硫素作用的分子機(jī)制。CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，蘿卜硫素呈濃度依賴性抑制A431細(xì)胞增殖，然而，不同劑量蘿卜硫素對(duì)A431細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用不及單純順鉑和順鉑+蘿卜硫素組，二者表現(xiàn)出協(xié)同作用。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，不同劑量蘿卜硫素組、單純順鉑組和順鉑+蘿卜硫素組均能引發(fā)A431細(xì)胞的早期凋亡，并且細(xì)胞早期凋亡率與蘿卜硫素劑量呈明顯正相關(guān)，順鉑+蘿卜硫素聯(lián)合給藥引起的細(xì)胞凋亡高于單純蘿卜硫素組和單純順鉑組，二者聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示蘿卜硫素、順鉑及聯(lián)合給藥能顯著降低Survivin蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)Caspase-3蛋白表達(dá)。

Cox-2在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)[10]，早期研究已證實(shí)Cox-2可誘導(dǎo)Akt磷酸化[20]，進(jìn)一步促使GSK-3β磷酸化[12]，該信號(hào)傳導(dǎo)的激活能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附、分化及凋亡等過程。本文研究也發(fā)現(xiàn)不同劑量蘿卜硫素組、單純順鉑組和順鉑+蘿卜硫素組均能顯著抑制Cox-2、p-Akt及p-GSK-3β表達(dá)，并且Cox-2、p-Akt及p-GSK-3β表達(dá)量與蘿卜硫素劑量呈明顯正相關(guān)，順鉑+蘿卜硫素聯(lián)合給藥抑制作用明顯高于單純蘿卜硫素和單純順鉑組，二者聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。

綜上所述，蘿卜硫素可通過誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖起著抗癌的活性，該生物學(xué)效應(yīng)可能與抑制Cox-2/Ak/GSK-3β信號(hào)傳導(dǎo)、上調(diào)Caspase-3及下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)相關(guān)。