霍君藝，趙卓偉，段策中，華 振，荊銀磊，孟祥海

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院燒傷整形科，陜西 西安 710038)

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合或不明原因所致皮膚損傷愈合后所形成的過度生長(zhǎng)的異常瘢痕組織，其通常表現(xiàn)為病變部位超出原始皮膚損傷范圍，并呈現(xiàn)可持續(xù)性生長(zhǎng)特征，主要形狀為結(jié)節(jié)狀、條索狀或片狀[1-2]。目前，根據(jù)大小可將其分為小型瘢痕疙瘩(直徑<2.0 cm)、中大型瘢痕疙瘩(長(zhǎng)度2.0～10.0 cm，寬度<5.0 cm)和超大型瘢痕疙瘩(長(zhǎng)度>10.0 cm，寬度≥5.0 cm)。對(duì)于不同類型的瘢痕疙瘩，采取不同的治療手段，主要包括藥物治療、手術(shù)治療和放射治療[3-4]。然而，由于瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，難以被治愈，因此研究瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制對(duì)開發(fā)瘢痕疙瘩的新療法意義重大。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同系物1(Silent information regulator 2 homologue 1，SIRT1)是一種在人體各種組織廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)。同時(shí)，SIRT1作為Sirtuin家族的重要成員，也是一種組蛋白去乙酰化酶，可以通過對(duì)多種組蛋白的調(diào)控而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和死亡的調(diào)控[5-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，SIRT1-SIRT3-SOD2-mROS依賴性自噬通路與基于5-氨基乙酰丙酸的光動(dòng)力療法治療瘢痕疙瘩的臨床療效有關(guān)。此外，SIRT1有希望成為肥厚性瘢痕的治療靶點(diǎn)[8]。然而，目前關(guān)于SIRT1在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)報(bào)道較少。鑒于此，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法和免疫印跡法檢測(cè)人瘢痕疙瘩組織中SIRT1基因表達(dá)，并探討SIRT1表達(dá)與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年12月在我院接受治療的瘢痕疙瘩患者82例，其中男性49例，女性33例；年齡22～63歲，平均(45.36±9.82)歲；胸部39例，腹部25例，肩部10例，耳后8例；病程3～16個(gè)月，平均(8.91±1.02)個(gè)月。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均未服用瘢痕抑制類藥物治療；②臨床病理診斷無(wú)惡變；③瘢痕組織未行物理治療；④患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并皮膚疾??；②合并惡性腫瘤或傳染性疾病；③瘢痕組織局部出現(xiàn)感染。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 研究方法 根據(jù)病程不同將82例瘢痕疙瘩患者分為A組(0～6個(gè)月，30例)、B組(6～12個(gè)月，27例)和C組(>12個(gè)月，25例)。每份瘢痕疙瘩組織標(biāo)本根據(jù)生長(zhǎng)期分為浸潤(rùn)部、增生部和老化部，并且每份瘢痕疙瘩組織取正常皮膚組織1份作為對(duì)照。檢測(cè)每位患者正常組織和瘢痕疙瘩組織(浸潤(rùn)部、增生部和老化部)中SIRT1基因表達(dá)情況，取多次檢測(cè)的平均值。此外，檢測(cè)正常組織和瘢痕疙瘩組織p65蛋白和p-p65蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)水平。

1.2.1 SIRT1 mRNA表達(dá)檢測(cè)：通過組織RNA提取試劑盒(批號(hào)：R218，北京金百特生物科技有限公司)提取正常組織和瘢痕疙瘩組織總RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：205111，北京凱幕生物科技有限公司)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后按照qPCR試劑盒(批號(hào)：LS-0064，重慶唯尚立德生物科技有限公司)說(shuō)明書配置反應(yīng)體系以檢測(cè)SIRT1 mRNA表達(dá)。SIRT1正向引物序列為5’-GGCTCTATACACAGAACATCGAC-3’，反向引物序列為5’-ATCATCGGCATTTTGAACGAGG-3’。內(nèi)參β-actin正向引物序列為5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’， 反向引物序列為5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATG-3’。

1.2.2 SIRT1、p65和p-p65蛋白表達(dá)檢測(cè)：通過組織蛋白提取試劑盒(批號(hào)：BB-3122-2，北京安鑫康科技有限公司)提取正常組織和瘢痕疙瘩組織總蛋白，然后采用BCA試劑盒(批號(hào)：23227，北京科創(chuàng)欣達(dá)科技有限公司)檢測(cè)總蛋白濃度。將50 μg總蛋白使用10% SDS-PAGE膠進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用5% BSA溶液封閉后進(jìn)行一抗孵育過夜，次日進(jìn)行二抗孵育，經(jīng)過壓片顯影后利用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行灰度分析。

2.4 正常組織與瘢痕疙瘩組織SOD、MDA和AOPP水平比較 見表4。瘢痕疙瘩組織中SOD、MDA和AOPP含量顯著高于正常組織(均P<0.05)。

2.2 三組患者瘢痕疙瘩組織不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 見表2。在各組內(nèi)，瘢痕疙瘩組織老化部、增生部SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于浸潤(rùn)部，且老化部高于增生部(均P<0.05)。三組間瘢痕疙瘩組織不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

第五，充分發(fā)揮各級(jí)礦業(yè)協(xié)會(huì)的協(xié)調(diào)、支撐作用。礦業(yè)協(xié)會(huì)應(yīng)提供理論指導(dǎo)、技術(shù)咨詢和第三方評(píng)估，加強(qiáng)對(duì)典型礦山的宣傳和先進(jìn)企業(yè)的經(jīng)驗(yàn)推介，擴(kuò)大在全社會(huì)范圍內(nèi)的影響。依托綠色礦業(yè)發(fā)展指導(dǎo)中心、綠色礦業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略聯(lián)盟等機(jī)構(gòu)，適時(shí)召開現(xiàn)場(chǎng)交流培訓(xùn)，整體提升礦業(yè)領(lǐng)域綠色治理能力。

2 結(jié) 果

面對(duì)這份要求和重?fù)?dān)，研究院黨委結(jié)合所面臨的工作環(huán)境，由班子成員帶隊(duì)深入各研究所與機(jī)關(guān)科室，開展了“訪基層、講形勢(shì)、聚人心、促工作”集中宣講，宣講形勢(shì)任務(wù)和上級(jí)政策要求，了解職工思想動(dòng)態(tài)；編發(fā)了形勢(shì)任務(wù)教育宣傳材料，開展“跨越重大關(guān)口，決勝扭虧為盈”形勢(shì)任務(wù)教育；使大家充分認(rèn)清形勢(shì)，明確研究院在分公司的定位，增強(qiáng)榮譽(yù)感，強(qiáng)化擔(dān)當(dāng)意識(shí)，在全院干部員工心目中樹立和固化“公司增效責(zé)任在我，公司發(fā)展我來(lái)?yè)?dān)責(zé)”的責(zé)任心，鼓勵(lì)員工以不服輸、爭(zhēng)口氣的勁頭，把基礎(chǔ)研究工作做得更扎實(shí)、更細(xì)致、更務(wù)實(shí)，努力打好翻身仗。

2.3 正常組織與瘢痕疙瘩組織p65蛋白、p-p65蛋白及p-p65/p65水平比較 見表3。正常組織和瘢痕疙瘩組織p65蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。瘢痕疙瘩組織p-p65蛋白表達(dá)水平和p-p65/p65顯著高于正常組織(均P<0.05)。

表1 三組患者正常組織和瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

表2 三組患者瘢痕疙瘩組織不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

床邊教學(xué)是一種重要的醫(yī)學(xué)教學(xué)方式，是以臨床帶教教師為主導(dǎo)、學(xué)生為主體、病人為中心的臨床教學(xué)模式，一直以來(lái)都為世界各國(guó)醫(yī)學(xué)院所推崇，在二十世紀(jì)前半葉被廣泛應(yīng)用于各醫(yī)學(xué)院校，到60年代約占75%的臨床培訓(xùn)時(shí)間[2]。床邊教學(xué)已被描述成為一種理想的臨床教學(xué)模式，通過專業(yè)的病史詢問和體格檢查，在病人診治過程中提供一個(gè)全面的方法。但近年來(lái)，影像醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，使床邊教學(xué)時(shí)間明顯減少了，床邊教學(xué)目前約占醫(yī)學(xué)培訓(xùn)的8%～19%[3]。在本科學(xué)習(xí)期間，若床邊教學(xué)這一重要內(nèi)容減少，可能會(huì)導(dǎo)致部分年輕醫(yī)學(xué)生臨床技能下降。

表3 正常組織與瘢痕疙瘩組織p65蛋白、p-p65蛋白及p-p65/p65水平比較

1.2.3 SOD、MDA和AOPP含量檢測(cè)：將正常組織和瘢痕疙瘩組織經(jīng)組織勻漿器勻漿后，離心以收集上清，分別采用SOD活性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：BC0170，上海吉至生化科技有限公司)、MDA含量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：BC0020，上海吉至生化科技有限公司)和AOPP ELISA試劑盒(批號(hào)：JM-04217H1，深圳市益百順科技有限公司)進(jìn)行含量檢測(cè)。

瘢痕疙瘩是一種病理性瘢痕，以成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原纖維異常沉積和炎癥為特征，表現(xiàn)出類似癌癥的特性，不會(huì)自發(fā)消退，切除后通常會(huì)復(fù)發(fā)。目前，臨床上對(duì)于瘢痕疙瘩有多種治療方法，但均被發(fā)現(xiàn)有療效低、不良反應(yīng)大和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高等特點(diǎn)，而造成瘢痕疙瘩無(wú)法被治愈的主要原因是其發(fā)病機(jī)制依然未被完全揭示[9]。Sirtuins是Ⅲ類組蛋白去乙?；福ㄟ^對(duì)組蛋白和非組蛋白底物的去乙?；l(fā)揮作用而參與衰老、表觀遺傳學(xué)、炎癥、癌癥和各種其他細(xì)胞過程[10]。Sirtuins蛋白家族共有7個(gè)蛋白，其中SIRT1是Sirtuins蛋白家族特征最明顯的蛋白，參與調(diào)節(jié)各類細(xì)胞活動(dòng)，包括代謝、增殖、分化、壞死和凋亡，在糖尿病、慢性炎癥性肺部、神經(jīng)退行性疾病、慢性腎病以及多種纖維化疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11-12]。而瘢痕疙瘩的特征是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度產(chǎn)生和沉積，與傷口處成纖維細(xì)胞的持續(xù)存在有關(guān)，所以SIRT1被認(rèn)為是治療瘢痕疙瘩的潛在靶點(diǎn)[8]。

表4 正常組織與瘢痕疙瘩組織SOD、MDA和AOPP水平比較

表5 瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)與SOD、MDA和AOPP的相關(guān)性

3 討 論

2.5 瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)與SOD、MDA和AOPP的相關(guān)性 見表5。在82例瘢痕疙瘩組織中，SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平與SOD、MDA和AOPP呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。

2.1 三組患者正常組織和瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 見表1。各組內(nèi)，SIRT1 mRNA和蛋白在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織(均P<0.05)。三組間SIRT1 mRNA和蛋白在正常組織和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

本研究通過qPCR和免疫印跡法分別檢測(cè)SIRT1 mRNA和蛋白在人瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT1基因在人瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組織，并且與瘢痕疙瘩病程無(wú)關(guān)，而與其在瘢痕疙瘩組織的表達(dá)部位有關(guān)。Bai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在肥厚性瘢痕組織中的表達(dá)受到抑制，但與本研究不同，他們進(jìn)一步探討了調(diào)節(jié)SIRT1對(duì)治療肥厚性瘢痕的可能性，而本研究則側(cè)重于研究SIRT1在人瘢痕疙瘩組織表達(dá)下調(diào)的臨床意義。進(jìn)一步分析可知：第一，在皮膚的各種細(xì)胞類型中，成纖維細(xì)胞負(fù)責(zé)合成膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并在傷口愈合和瘢痕形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-14]；第二，皮膚損傷后，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其特點(diǎn)是表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，合成和分泌膠原蛋白的傾向增加，從而促進(jìn)傷口愈合。然而，傷口愈合后成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的持續(xù)存在可能導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成[13-14]；第三，研究表明上調(diào)SIRT1的表達(dá)可以抑制腎纖維化、肝纖維化和肺纖維化[15-17]，而SIRT1抑制劑則可以通過抑制5-氨基乙酰丙酸誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的凋亡[7]。因此，在人瘢痕疙瘩組織表達(dá)降低的SIRT1可能與瘢痕疙瘩的形成有關(guān)。

工程量清單計(jì)價(jià)模式主要起始于21世紀(jì)初期，其主要是在我國(guó)以往定額計(jì)價(jià)模式的基礎(chǔ)上，通過量、價(jià)分離的方式，以市場(chǎng)價(jià)格、工程承包方內(nèi)部定額確定招投標(biāo)價(jià)格。工程量清單計(jì)價(jià)模式將工程量核算、項(xiàng)目劃分及計(jì)量單位設(shè)置進(jìn)行了統(tǒng)一管理，而統(tǒng)一工程量計(jì)量、項(xiàng)目名稱編碼及計(jì)算規(guī)則的設(shè)置，也對(duì)承包方工程造價(jià)控制提出了更高的要求。

生態(tài)文明改革成果不僅讓城里人得惠得利，也延伸到鄉(xiāng)下，讓村里人可感可觸。污水處理設(shè)施投入使用以來(lái)，全村40多戶村民“污水四處流、坑塘水溝臭氣熏天”的環(huán)境問題得到了解決，有效改善了生態(tài)環(huán)境，提升了群眾的生活質(zhì)量。

氧化應(yīng)激指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。近年來(lái)，多種氧化應(yīng)激指標(biāo)或氧化應(yīng)激相關(guān)通路被發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)異常，表明氧化應(yīng)激參與了瘢痕疙瘩的形成[18]?；诖?，本研究首先檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)通路(核因子-κB信號(hào)通路)和氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、MDA和AOPP)在人瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人瘢痕疙瘩組織p-p65蛋白表達(dá)水平和p-p65/p65，以及SOD、MDA和AOPP含量均高于正常組織，這與之前的研究結(jié)果一致。重要的是，本研究還發(fā)現(xiàn)在82例瘢痕疙瘩組織中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)與氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、MDA和AOPP)均呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步分析可知：瘢痕疙瘩是發(fā)病率極高的纖維化疾病，瘢痕疙瘩組織中存在高水平的活性氧(氧化應(yīng)激程度較高的標(biāo)志)不僅可以促進(jìn)一些重要的纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，而且參與調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡[19]；而近年來(lái)研究[20]表明，SIRT1可以通過其去乙?；饔迷谘趸瘧?yīng)激狀態(tài)下調(diào)控多種靶蛋白的表達(dá)和修飾，包括p53、p65以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)等，以抵抗氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、代謝和凋亡發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，SIRT1在人瘢痕疙瘩組織中表達(dá)降低，其表達(dá)水平與人瘢痕疙瘩病程無(wú)關(guān)，而與其在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)部位有關(guān)，并且可能通過抵抗氧化應(yīng)激而參與瘢痕疙瘩的形成與發(fā)展。