趙海燕，張鴻婷，李佳卓，魏明慧，姜芊竹

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕科，黑龍江 哈爾濱 150001)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是在40歲以后成人殘疾發(fā)病和關(guān)節(jié)改變的最重要原因之一[1]。KOA治療藥物包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、軟骨保護(hù)劑等，但療效受限。中藥治療KOA逐漸受到重視[2]。膝骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)上屬于“膝痹”范疇，為本虛標(biāo)實(shí)之證。多因素體虧虛，風(fēng)寒濕邪乘虛侵犯機(jī)體，寒濕凝滯經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致氣血不暢，引發(fā)關(guān)節(jié)疼痛腫脹[3]。膝骨關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作時(shí)膝關(guān)節(jié)腫脹明顯，以邪實(shí)為著，故治療上常以健脾祛濕為主，溫經(jīng)通絡(luò)為輔[4]。溫化方是我院治療膝骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，以黃芪防己湯合五苓散加減為組方。經(jīng)多年臨床研究證實(shí)該方治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效較好[5]。在KOA的病理改變中，以核轉(zhuǎn)錄因子B(Nuclear factor kappa B，NF-κB)的反應(yīng)性激活與滑膜和局部組織炎性侵蝕的關(guān)系密切[6]。抑制NF-κB通路可以調(diào)控炎癥反應(yīng)，減少成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的擴(kuò)增，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，從而減輕軟骨和骨組織的侵蝕，減少破骨細(xì)胞分化[7]。本研究旨在探討溫化方對(duì)大鼠KOA及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SPF SD大鼠50只，10～12周齡，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2018-0005]，體重210～240 g，所有大鼠均在室溫24 ℃、正常晝夜節(jié)律、自由進(jìn)食和飲水條件下喂養(yǎng)1周左右。經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，在動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下開(kāi)展實(shí)驗(yàn)工作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：Ⅱ膠原蛋白(批號(hào)190213)，弗氏不完全佐劑(批號(hào)180321)，PCR試劑盒(批號(hào)A20190820，大連寶生物工程有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒IL-1β(批號(hào)200408)，IL-6 試劑盒(批號(hào)191004)，TNF-α試劑盒(批號(hào)200405，武漢博士德生物科技有限公司)，PCR試劑盒(批號(hào)P200407，美國(guó)Sigma公司)，凝膠快速制備盒(批號(hào)00920KD1，美國(guó)Axygen公司)，NF-κB p65、β-actin (批號(hào)M200409、FX191015，美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 KOA模型的建立：參考既往文獻(xiàn)[8]造模，即牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L冰醋酸,最終濃度為2 mg/ml放置在4 ℃冰箱中過(guò)夜,次日將其與等量的弗氏不完全佐劑完全乳化在大鼠左后跖底部注射乳劑0.2 ml/只,7 d后再次免疫,即尾根部注射乳劑0.2 ml,進(jìn)而誘發(fā)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，大鼠足爪紅腫,足墊增厚,行動(dòng)遲緩,踝關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),病理切片提示滑膜增厚,表示造模成功。

1.2.2 分組與處理：在第15天時(shí)，隨機(jī)選取構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎的模型大鼠40 只，隨機(jī)分為模型組、溫化方組、雙氯芬酸鈉組、抑制劑組。溫化方組大鼠以每日0.3 g/kg劑量的溫化方進(jìn)行灌胃，藥物組成：黃芪30 g,防己、益母草、桂枝、茯苓、澤瀉、豬苓各15 g,生白術(shù)20 g,生甘草10 g。雙氯芬酸鈉組的大鼠每天以5 mg/kg雙氯芬酸鈉溶液灌胃；抑制劑組每日予NF-κB抑制劑100 mg/kg灌胃；模型組每日予1 ml/g的0.9%氯化鈉灌胃。對(duì)照組大鼠不予干預(yù)。干預(yù)28 d后，用40 mg/kg戊巴比妥鈉[9]麻醉大鼠，留取血清和滑膜組織。

1.2.3 HE染色：滑膜組織切片用二甲苯變性，經(jīng)不同濃度的酒精水合，并根據(jù) HE 的階梯包被并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行掃描。切片在蘇木紫和伊紅溶液中浸泡。蒸餾水浸泡后，隨后在酒精中脫水，用二甲苯透明后，加中性還原劑密封。

1.2.4 體重、關(guān)節(jié)腫脹度檢測(cè)：每7 d測(cè)量1次大鼠體重。關(guān)節(jié)腫脹程度評(píng)估：每7 d測(cè)量大鼠膝關(guān)節(jié)周徑。關(guān)節(jié)腫脹程度=建模后同側(cè)膝關(guān)節(jié)周徑-建模前同側(cè)膝關(guān)節(jié)周徑[10]。

1.2.5 血清中炎癥因子檢測(cè)：末次給藥后禁食24 h，腹主動(dòng)脈取血，離心，分離血清，ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定其血清炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平。參考 ELISA試劑盒的檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR分析NF-κB p65基因表達(dá)水平：通過(guò) RNA 提取包從大鼠滑膜組織中提取 RNA。1 μg RNA 和 cDNA 被 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化。PCR引物序列，見(jiàn)表1。使用β-actin作為內(nèi)部參數(shù)。PCR擴(kuò)增狀態(tài)參數(shù)設(shè)置為94 ℃，5 min，變性94 ℃，40 s，60 ℃，40 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。采用2-△△Ct法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot檢測(cè)滑膜組織NF-κB p65蛋白表達(dá)：采集各組大鼠的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，組織蛋白提取試劑盒獲取組織總蛋白，放入液氮研缽中快速分解。抽提核蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白。取蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，遷移至半干聚偏氟乙烯膜，加入人NF-κB p65 抗體(1∶500 溶液)，過(guò)夜孵育，裂解，膜洗滌，ECL 顯色，用凝膠圖像拍照與檢查所測(cè)蛋白質(zhì)和β-actin灰度比作為蛋白數(shù)值表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 溫化方對(duì)KOA大鼠滑膜組織損傷的影響 見(jiàn)圖1。HE染色觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組的膝關(guān)節(jié)部分光滑，軟骨滑膜組織完整，細(xì)胞分布適當(dāng)。模型組的軟骨滑膜組織可見(jiàn)諸多的炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，深部的軟骨細(xì)胞核壓扁，細(xì)胞質(zhì)肥大，波線(xiàn)消失，細(xì)胞重排。與模型組相比，雙氯芬酸鈉組、抑制劑組和溫化方組軟骨組織的損傷明顯縮小，細(xì)胞分布調(diào)整相對(duì)均勻，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)緩慢恢復(fù)趨于正常組織細(xì)胞形態(tài)。

圖1 各組大鼠滑膜組織變化(HE染色，×100)

2.2 各組大鼠體重、關(guān)節(jié)腫脹度比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，模型組大鼠體重較輕，關(guān)節(jié)腫脹度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，溫化方組、雙氯芬酸鈉組及抑制劑組的大鼠體重升高，關(guān)節(jié)腫脹度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組大鼠體重、關(guān)節(jié)腫脹程度比較

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和 IL-1β比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 均高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，溫化方組、雙氯芬酸鈉組、抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和 IL-1β比較(ng/L)

2.4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB p65 mRNA與NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4。以對(duì)照組為參照，其他各組的 NF-κB p65 mRNA及蛋白值均為與對(duì)照組的比值。與模型組比較，溫化方組、雙氯芬酸鈉組、抑制劑組NF-κB p65 mRNA表達(dá)均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，溫化方組、雙氯芬酸鈉組、抑制劑組、 NF-κB p65 蛋白表達(dá)均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB p65 mRNA與NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

3 討 論

KOA屬于中醫(yī)“膝痹”范疇。肝腎虧虛、瘀血阻滯是KOA的主要病機(jī)，腎主骨，肝主筋，膝為筋之府，故肝腎虧虛是發(fā)病基礎(chǔ)，血瘀是重要因素[11]。長(zhǎng)期機(jī)體失衡使患者產(chǎn)生關(guān)節(jié)腫脹、僵硬、疼痛等癥狀。臨床常用健脾祛濕為主，溫經(jīng)通絡(luò)為輔，治療KOA[12]。溫化方是我院治療KOA的經(jīng)驗(yàn)方劑，以黃芪防己湯合五苓散加減為組方。經(jīng)多年臨床研究，證實(shí)該方治療KOA療效較好。脾胃是后天之本，并且是生化之源。肝腎和氣血的補(bǔ)充都依賴(lài)于后天之本，肝腎和，氣血充足才能保證人體不受風(fēng)寒濕外邪侵犯。以防己黃芪湯加味治療，可以益氣補(bǔ)腎，除濕活血。黃芪與防己配伍為君，固表祛風(fēng)；白術(shù)、益母草、生甘草等為臣，發(fā)揮補(bǔ)氣健脾祛濕等作用，而桂枝、澤瀉和豬苓可以調(diào)和諸藥[3]。

免疫炎癥損傷是KOA重要的發(fā)病機(jī)制[13-14]。在這個(gè)過(guò)程中，NF-κB 信號(hào)通路的作用很重要[15]。NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子，激活后可上調(diào)TNF-α、IL-6 和IL-1β等炎癥因子表達(dá)，激活炎癥反應(yīng)[16]。另外，NF-κB還與凋亡、線(xiàn)粒體損傷等有關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的激活與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如腫瘤、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病等[18-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者關(guān)節(jié)滑液和外周血的NF-κB表達(dá)水平會(huì)升高，并且NF-κB信號(hào)通路的激活程度與軟骨侵蝕和破壞程度呈正相關(guān)[7,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA大鼠血清和關(guān)節(jié)組織中NF-κB、TNF-α、IL-6 、IL-1β表達(dá)水平上調(diào)，與既往報(bào)道一致，提示NF-κB信號(hào)通路可能是KOA的治療靶點(diǎn)。

在本研究中，相比模型組、溫化方組、雙氯芬酸鈉組及抑制劑組的大鼠滑膜損傷和纖維增生明顯減輕；相比模型組、溫化方組、雙氯芬酸鈉組及抑制劑組的大鼠體重明顯增加，關(guān)節(jié)腫脹度則降低。相比模型組，溫化方組、雙氯芬酸鈉組、抑制劑組的RT-qPCR法和Western blot檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平均降低，提示溫化方可有效改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠臨床癥狀，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，溫化方能抑制Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)一步闡明了溫化方治療KOA的作用機(jī)制。