萬 里 吳國芳 王 磊* 張曉衛(wèi) 馮宇哲

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016；2.青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016；3.青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，西寧810016；4.青海省高原家畜遺傳資源保護(hù)及創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

受非洲豬瘟和新冠疫情雙重影響，飼料原料價(jià)格不斷飆升，養(yǎng)殖成本成倍增加，如何降低養(yǎng)殖成本迫在眉睫[1]?？股刈鳛轱暳咸砑觿┍粡V泛使用，其顯著增加了養(yǎng)殖效益，但對(duì)人類、動(dòng)物健康以及生態(tài)環(huán)境都造成了嚴(yán)重危害[2]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已于2020年發(fā)文在飼料端禁抗，而益生菌發(fā)酵飼料由于具有無污染、品質(zhì)高、適口性好、利用率高、可部分替代抗生素等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注[3]，益生菌發(fā)酵可將植物性農(nóng)副產(chǎn)品等原料分解成多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等一些大分子物質(zhì)，生成有機(jī)酸、可溶性小肽等小分子物質(zhì)和大量的菌體蛋白，形成營養(yǎng)豐富、適口性好的生物飼料[4]。

乳酸菌是影響青貯飼料發(fā)酵的主要益生菌，屬于兼性厭氧型細(xì)菌，通過對(duì)糖發(fā)酵形成乳酸，從而降低pH，抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，減少發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)水解和干物質(zhì)損失[5]。乳酸菌可分為同型乳酸菌和異型乳酸菌兩大類。在飼料中接種同型乳酸菌，飼料發(fā)酵后NH3-N含量和pH較低[6]。異型乳酸菌可增加發(fā)酵飼料中乙酸的含量，抑制好氧腐敗菌的繁殖，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[7]。酵母菌屬于兼性厭氧型真菌，其一方面在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒香味或蘋果芳香味，從而提高飼料風(fēng)味和動(dòng)物采食量，另一方面在發(fā)酵過程中通過自身產(chǎn)生的酶將飼料中的大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，進(jìn)而提高飼料利用率[8]；同時(shí)，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸可降低發(fā)酵飼料pH，抑制病原菌生長(zhǎng)，提高發(fā)酵飼料營養(yǎng)價(jià)值[9]。添加促進(jìn)某些微生物定植的添加劑可以對(duì)反芻動(dòng)物的營養(yǎng)方式進(jìn)行干預(yù)[10]。已有研究表明，在反芻動(dòng)物飼糧中添加適量的乳酸菌、酵母菌等益生菌可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，改善肉品質(zhì)[11]，優(yōu)化血液生化指標(biāo)[12]，提高瘤胃功能[13]。

目前關(guān)于益生菌發(fā)酵精補(bǔ)料的報(bào)道較少，因此，本試驗(yàn)使用復(fù)合益生菌對(duì)育肥牦牛精補(bǔ)料進(jìn)行發(fā)酵，通過發(fā)酵條件優(yōu)化、微生物群落分析以及發(fā)酵后飼料品質(zhì)鑒定，全面地對(duì)發(fā)酵飼料進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為益生菌發(fā)酵飼料在牦牛育肥生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

3株乳酸菌：鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，YLW001菌株，菌種保藏號(hào)CCTCC M 2018759)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici，YLW002菌株，菌種保藏號(hào)CCTCC M 2018760)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，YLW003菌株，菌種保藏號(hào)CCTCC M 2018761)；2株酵母菌：釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，JZ9菌株，菌種保藏號(hào)CCTCC M 2020844)、畢赤酵母菌(Pichiapastoris，JZ10菌株，菌種保藏號(hào)CCTCC M 2020843)。以上菌株均由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、吐溫-80 1 mL、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、超純水1 000 mL。YPD液體培養(yǎng)基(1 L)：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、超純水1 000 mL。以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 精補(bǔ)料

試驗(yàn)所用育肥牦牛精補(bǔ)料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及活菌數(shù)測(cè)定

乳酸菌的活化：將凍存的3株乳酸菌菌液解凍后，分別取20 μL，同時(shí)加入到裝有MRS液體培養(yǎng)基的15 mL的離心管中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，采用稀釋平板涂布的方法進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定，測(cè)得乳酸菌總活菌數(shù)為6×108CFU/mL。

酵母菌的活化：將凍存的2株酵母菌菌液解凍后，分別取20 μL，同時(shí)加入到裝有YPD液體培養(yǎng)基的15 mL的離心管中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，采用稀釋平板涂布的方法進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定，測(cè)得酵母菌總活菌數(shù)為1×108CFU/mL。

1.2.2 發(fā)酵參數(shù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

發(fā)酵條件優(yōu)化使用4因素3水平正交設(shè)計(jì)，共設(shè)9個(gè)組。用電子秤稱取1.5 kg的精補(bǔ)料，按照正交設(shè)計(jì)表(表2)算出所需酵母菌和乳酸菌的體積數(shù)，以及所用水的體積數(shù)(扣除菌液總體積)，將菌液倒入水中，搖勻，均勻地灑在精補(bǔ)料上，拌勻之后分別裝入500 mL的絲口試劑瓶中，每組4個(gè)重復(fù)，壓實(shí)、蓋好蓋子，按照正交設(shè)計(jì)的溫度分別放入到3個(gè)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)箱中，發(fā)酵5 d后取出，測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。以上一步優(yōu)化條件得到的最優(yōu)組合對(duì)精補(bǔ)料進(jìn)行發(fā)酵，設(shè)定的發(fā)酵時(shí)間分別為0、1、3、5、7、10、15 d。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分含量和有氧穩(wěn)定性，以確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

發(fā)酵飼料的pH使用便攜式pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，氨態(tài)氮(NH3-N)、可溶性糖(SS)、淀粉(ST)含量使用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)含量使用陜西眾美生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

微生物群落結(jié)構(gòu)：使用Illumina公司的MiSeqPE-300平臺(tái)(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行16S測(cè)序，然后進(jìn)行α多樣性、β多樣性、LEfSe、相關(guān)性分析。

發(fā)酵飼料中CP(GB/T 6432—2018)、NDF(GB/T 20806—2006)、ADF(NY/T 1459—2007)含量采用相應(yīng)的國標(biāo)方法測(cè)定，纖維素酶(CL)、脂肪酶(LPS)、酸性蛋白酶(ACP)、α-淀粉酶(α-AL)、β-淀粉酶(β-AL)活性使用蘇州科銘生物技術(shù)科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

有氧穩(wěn)定性：將發(fā)酵完的飼料依次完全暴露在空氣中10、20、30、40、50、60 d，在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)測(cè)定飼料中心的溫度和pH，并記錄環(huán)境溫度，當(dāng)飼料中心溫度高出環(huán)境溫度2 ℃的時(shí)間即為有氧穩(wěn)定的臨界時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

正交設(shè)計(jì)結(jié)果采用極差分析法確定最優(yōu)的組合。微生物群落數(shù)據(jù)使用美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行分析，按照97%序列相似度進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，對(duì)樣本進(jìn)行均一化處理，分析α多樣性，并采用Student’st-test方法進(jìn)行組間差異性分析。主坐標(biāo)分析(PCoA)基于bray-curtis距離，組間差異性采用Adonis方法進(jìn)行分析。LEfSe分析默認(rèn)LDA-Score的篩選值為2.0。相關(guān)性分析使用R里面的rcorr函數(shù)、Pearson參數(shù)，計(jì)算差異菌種和表型的相關(guān)系數(shù)和P值，用熱圖呈現(xiàn)，*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。發(fā)酵飼料成分指標(biāo)數(shù)據(jù)使用SAS 8.2軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。文章中的圖片使用Origin 2018、美吉生物云平臺(tái)以及R語言4.0.5軟件繪制而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計(jì)結(jié)果

飼料中營養(yǎng)成分和霉菌毒素含量正交試驗(yàn)結(jié)果分別見表3和表4。通過極差分析得出的主次序可以看出，NH3-N含量受D因素即水料比的影響最大，并且在D3、D7水平下含量較低，得到NH3-N含量的優(yōu)化組為G3、G7組；SS含量受A因素即接種量的影響最大，并且在A1、A2水平下含量較高，得到SS含量的優(yōu)化組為G4、G6組；各組的pH差異不大，因此不需要優(yōu)化；利用同樣的方法得到ST含量的優(yōu)化組為G6組，AFB1含量的優(yōu)化組為G1、G7組，ZEN含量的優(yōu)化組為G1、G7組，DON含量的優(yōu)化組為G5、G7組。由于G4組NH3-N含量過高、ST含量過低，G6組NH3-N、AFB1、DON含量過高，G5和G7組SS含量過低，G1組NH3-N含量過高，不符合要求，因此確定G3組為最優(yōu)組。

2.2 不同處理對(duì)飼料中微生物群落的影響

2.2.1 不同處理對(duì)飼料中微生物群落α多樣性和β多樣性的影響

為了分析飼料中微生物群落的α多樣性，計(jì)算Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，并進(jìn)行指數(shù)間差異分析，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看到，G3組Shannon指數(shù)顯著高于G1、G2、G4、G6、G7、G8、G9組(P<0.05)，略高于G5組(P>0.05)；G3組Simpson指數(shù)顯著低于G1、G2、G4、G6、G7、G8、G9組(P<0.05)，略低于G5組(P>0.05)。上述結(jié)果說明G3組飼料中微生物群落的α多樣性高于其他組。

在OTU水平上，基于bray-curtis距離進(jìn)行PCoA，結(jié)果如圖2所示，G3、G5、G7組間分組聚類明顯，G1、G2、G4、G6、G8、G9組間分組聚類不明顯，使用Adonis方法進(jìn)行組間差異分析發(fā)現(xiàn)，G3組與G1、G2、G4、G7、G6、G8、G9組差異顯著(P<0.05)，與G5組差異不顯著(P>0.05)，這說明G3組飼料中微生物群落的β多樣性高于其他組。

2.2.2 不同處理對(duì)飼料中微生物群落組成的影響

如圖3所示，在種水平上，G1、G2、G4、G6、G8、G9組的優(yōu)勢(shì)菌種為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，分別占總豐度的99.20%、98.37%、98.18%，99.20%、99.24%、98.06%，G3、G5、G7組的優(yōu)勢(shì)菌種為L(zhǎng)actobacillusplantarum、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，其中在G3組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis分別占總豐度的65.35%、32.56%；G5組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis分別占總豐度的65.43%、33.86%，在G7組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis分別占總豐度的83.10%、16.34%。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，G3組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis的相對(duì)豐度與G1、G2、G4、G5、G6、G8、G9組差異顯著(P<0.05)，與G7組差異不顯著(P>0.05)。此外，G1組中還有少量的密執(zhí)安棒形桿菌(Clavibactermichiganensis)、金色馬賽菌(Massiliaaurea)，分別占總豐度的0.007 6%、0.006 4%；G2組中有少量的類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)、泡囊短波單胞菌(Brevundimonasvesicularis)，分別占總豐度的0.003 8%、0.004 1%；G3組中Pediococcusacidilactici占總豐度的1.7%，高于其他組；G5、G8組中青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)分別占總豐度的0.020%、0.015%；G6組中Clavibactermichiganensis、Massiliaaurea、Brevundimonasvesicularis分別占總豐度的0.003 6%、0.002 5%、0.002 5%。

對(duì)差異微生物進(jìn)行LEfSe，由LDA判別柱形圖(圖4)發(fā)現(xiàn)，G1組以葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、Staphylococcales、葡萄球菌屬(Staphylococcus)為主，G3組以片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)為主，G4組以Lactobacillus為主，G5組以乳桿菌科(Lactobacillaceae)、Lactobacillusbrevis為主，G7組以乳桿菌目(Lactobacillales)、厚壁菌門(Firmicutes)、桿菌綱(Bacilli)為主，G8組以Lactobacillales、Lactobacillusplantarum為主，G9組以Lactobacillusrhamnosus、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、明串珠菌屬(Leuconostoc)為主。

2.2.3 飼料微生物與飼料指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性

以計(jì)算出的Pearson相關(guān)系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，將飼料AFB1、ZEN、DON、NH3-N、ST、SS含量及pH與微生物在屬水平上的物種進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(圖5)發(fā)現(xiàn)：AFB1含量與Norank_Mitochondria相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；ZEN含量與Norank_Mitochondria、Leuconostoc相對(duì)豐度呈顯著的正相關(guān)(P<0.05)；NH3-N含量與Leuconostoc、Staphylococcus、未分類乳桿菌目(Unclassified_Lactobacillales)相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與Pediococcus相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與短桿菌屬(Curtobacterium)、棒形桿菌屬(Clavibacter)、Norank_Mitochondria相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；ST含量與泛生菌屬(Pantoea)、Leuconostoc、Curtobacterium、Norank_Mitochondria、Unclassified_Lactobacillales相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與假單胞菌屬(Pseudomonas)相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；SS含量與Staphylococcus相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；pH與Staphylococcus相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與Unclassified_Lactobacillales相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.3 發(fā)酵天數(shù)對(duì)飼料發(fā)酵指標(biāo)的影響

2.3.1 發(fā)酵天數(shù)對(duì)飼料中CP、NDF、ADF含量的影響

從圖6可以看出，與發(fā)酵第0天(未發(fā)酵)時(shí)相比，發(fā)酵第1～15天的飼料中CP含量均有不同程度的升高，以發(fā)酵第5天時(shí)最高，顯著高于發(fā)酵第0、1、10、15天時(shí)(P<0.05)，而發(fā)酵第1、10、15天與發(fā)酵第0天差異不顯著(P>0.05)；飼料中NDF、ADF含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加先降低后升高，發(fā)酵第1～15天的飼料中NDF、ADF含量均顯著低于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，以發(fā)酵第5天時(shí)最低，發(fā)酵7 d后不再有顯著變化(P>0.05)。

2.3.2 發(fā)酵天數(shù)對(duì)飼料中NH3-N、SS、ST含量以及pH的影響

從圖7可以看出，飼料中NH3-N含量在發(fā)酵第3、7、10、15天時(shí)顯著高于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，發(fā)酵第1天時(shí)顯著低于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，發(fā)酵第5天時(shí)與發(fā)酵第0天時(shí)差異不顯著(P>0.05)，以發(fā)酵第15天時(shí)最高，但與發(fā)酵第3、10天時(shí)差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵第1～15天的飼料中SS含量顯著低于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)；飼料中ST含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加總體呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵第1天時(shí)與發(fā)酵第0天時(shí)差異不顯著(P>0.05)，其余發(fā)酵天數(shù)均顯著低于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)；飼料的pH隨發(fā)酵天數(shù)的增加持續(xù)降低，且發(fā)酵第1～15天的飼料的pH均顯著低于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，以發(fā)酵第10、15天時(shí)較低。

2.3.3 發(fā)酵天數(shù)對(duì)飼料中酶活性的影響

從圖8可以看出，飼料中纖維素酶活性只有發(fā)酵在第5天時(shí)顯著高于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，除發(fā)酵第3天時(shí)略有升高外，其余發(fā)酵天數(shù)時(shí)均略有升高，但差異不顯著(P>0.05)；飼料中脂肪酶活性隨發(fā)酵天數(shù)的增加先升高后降低之后保持穩(wěn)定，且飼料中脂肪酶活性在發(fā)酵第1～15天時(shí)均顯著高于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，以發(fā)酵第5天時(shí)活性最高；飼料中α-淀粉酶活性在發(fā)酵第1、5天時(shí)顯著高于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，發(fā)酵第3、7天時(shí)較發(fā)酵第0天時(shí)略有升高，但差異不顯著(P>0.05)，發(fā)酵第10天時(shí)開始降低，與發(fā)酵第0天時(shí)差異不顯著(P<0.05)；飼料中β-淀粉酶活性在發(fā)酵第1、3天時(shí)與發(fā)酵第0天時(shí)相比略有升高，在發(fā)酵第5、7天時(shí)與發(fā)酵第0天時(shí)相比略有降低，但差異均不顯著(P>0.05)，從發(fā)酵第10天時(shí)開始顯著降低(P<0.05)。飼料中酸性蛋白酶活性隨發(fā)酵天數(shù)的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，且發(fā)酵第1～15天時(shí)均顯著高于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，以發(fā)酵第5天時(shí)最高。

2.3.4 發(fā)酵天數(shù)對(duì)飼料中霉菌毒素含量的影響

從圖9可以看出，發(fā)酵第1～15天時(shí)飼料中AFB1、ZEN和DON含量均顯著低于發(fā)酵第0天時(shí)(P<0.05)，其中AFB1含量均以發(fā)酵第15天時(shí)最低，ZEN含量以發(fā)酵第10天時(shí)最低，DON含量從發(fā)酵第5天開始趨于平穩(wěn)，不再有顯著變化(P>0.05)。

2.3.5 發(fā)酵天數(shù)對(duì)飼料有氧穩(wěn)定性的影響

從圖10可以看出，隨著暴露時(shí)間的增加，飼料的中心溫度逐步升高，當(dāng)暴露20 d時(shí)，飼料的中心溫度高出環(huán)境溫度2 ℃。暴露0～20 d時(shí)pH基本在4.5以下，與發(fā)酵時(shí)的pH基本保持一致，暴露20～30 d期間pH快速升高，暴露40 d時(shí)pH達(dá)到最高，說明暴露20 d以后飼料開始腐敗，飼料的有氧穩(wěn)定的臨界時(shí)間為20 d。

3 討 論

3.1 最優(yōu)發(fā)酵條件的確定

混合菌發(fā)酵時(shí)的接種量、接種比例、溫度、水料比是影響發(fā)酵的主要因素[14]，接種量的多少會(huì)通過改變菌的代謝影響發(fā)酵結(jié)果，過多則代謝物太多發(fā)酵不充分，過少則生長(zhǎng)底物剩余。接種比例適宜可促進(jìn)菌株共同生長(zhǎng)，不適宜則兩者中的一種對(duì)底物消耗太多，影響另一種生長(zhǎng)，或者一種大量生長(zhǎng)產(chǎn)生過多代謝物抑制另一種生長(zhǎng)，影響發(fā)酵效果。溫度則主要影響酶促效率，由于酵母菌和乳酸菌生長(zhǎng)的最適溫度不同，在溫度的選擇上應(yīng)考慮到兩者生長(zhǎng)曲線的交叉點(diǎn)，保證兩者共同生長(zhǎng)。水料比太大影響到氧氣的流動(dòng)，會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，太小則底物的溶解度降低，影響底物的利用率。飼料中SS、ST含量較高為宜，NH3-N、pH、毒素含量較低為宜。影響指標(biāo)的主次順序與極差的大小呈正相關(guān)，結(jié)合方差分析可得到G3組最符合要求，即接種量5%，接種比例2∶1，溫度30 ℃，水料比1∶1。周靜等[15]采用單因素接種比例研究酵母菌和乳酸菌的共生機(jī)制時(shí)，設(shè)置接種比例分別為2∶1、1∶1、3∶2、1∶2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種比例為3∶2時(shí)總活菌數(shù)最多。吝常華[16]研究顯示，用芽孢桿菌、Lactobacillusplantarum和Saccharomycescerevisiae發(fā)酵豆粕時(shí)，最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量15%、水料比1∶1、溫度31 ℃；用枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵豆粕時(shí)，最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量10%、水料比1.2∶1、溫度40 ℃。本試驗(yàn)所得到的最優(yōu)發(fā)酵條件部分與上述研究相一致，部分有差別，可能與測(cè)定指標(biāo)、菌種不一致有關(guān)。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)飼料微生物群落的影響

本試驗(yàn)中G3組飼料中微生物的α多樣性和β多樣性均高于其他組。乳酸菌是厭氧發(fā)酵最主要的細(xì)菌[17]。有研究表明，乳酸含量降低，飼料中pH增大，飼料中一些不耐酸的微生物就會(huì)大量繁殖，導(dǎo)致微生物的多樣性增加[18]。G3、G6、G7組飼料中酵母菌和乳酸菌的接種比例為2∶1，G1、G5、G8組為1∶1，G2、G4、G9組為1∶2，因此G2、G4、G9組飼料中微生物多樣性較低。有研究表明酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵前5 d，酵母菌可促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)[19]，從種水平上物種豐富度來看，G3組Lactobacillusbrevis的相對(duì)豐度提高，并且還有一部分為Pediococcusacidilactici，因此G3組的多樣性最高。同時(shí)，在種水平相對(duì)豐度上顯示，G1組中有少量的Clavibactermichiganensis，G2組中有少量的Brevundimonasvesicularis，G5、G8組中有少量的Ralstoniasolanacearum，G6組中有少量的密執(zhí)安棒狀桿菌、Brevundimonasvesicularis。研究表明：Ralstoniasolanacearum、Clavibactermichiganensis都是致病菌，可導(dǎo)致植物萎蔫致死[20-21]，Brevundimonasvesicularis也是一種致病菌，但不同于以上的菌種，它能夠引起動(dòng)物肺部感染、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等疾病[22]，因此G1、G2、G5、G6、G8組不符合要求。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)G1組有葡萄球菌，G9組有明珠串球菌，而葡萄球菌為致病菌，能產(chǎn)生使血液凝固的酶，以及殺死細(xì)胞，明珠串球菌為危害菌，常能使蔬菜、糖類等發(fā)黏而影響加工，因此G1、G9組都不符合要求。而對(duì)于G3、G4、G7組，G3組中Pediococcusacidilactici的相對(duì)豐度高于其他組，Pediococcusacidilactici作為乳酸菌的一類，有助于提高飼料品質(zhì)，所以G3組相對(duì)于其他組更有優(yōu)勢(shì)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳酸菌對(duì)AFB1、ZEN、DON、ST、SS有抑制作用，而片球菌對(duì)NH3-N、pH有抑制作用，對(duì)ST、SS有促進(jìn)作用，有研究表明：乳酸菌對(duì)AFB1、ZEN、DON都有一定的降解能力，而乳酸菌在發(fā)酵過程中需要能量來維持自身的生長(zhǎng)，因此ST和SS被消耗。乳酸菌在增殖過程中由于產(chǎn)酸而使得pH降低，因而抑制蛋白酶的活性，使得蛋白質(zhì)損耗減少，從而對(duì)NH3-N起抑制作用[23]，LEfSe分析發(fā)現(xiàn)G3組主要以Pediococcus、Lactobacillus為主，因此G3組符合要求。

3.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵對(duì)飼料營養(yǎng)成分及pH的影響

飼料中NDF、ADF和CP的含量是評(píng)價(jià)飼料品質(zhì)最重要的指標(biāo)，NDF和ADF含量越低，CP含量越高，表明飼料品質(zhì)越好[24]。NDF、ADF含量降低的原因可能與發(fā)酵過程中產(chǎn)生分解纖維的酶類將植物細(xì)胞壁中的纖維降解為水溶性碳水化合物有關(guān)[25]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵到第5天時(shí)飼料中纖維素酶的活性最高，因此發(fā)酵到第5天時(shí)飼料中NDF、ADF的含量最低。蛋白質(zhì)含量提高的原因可能是在發(fā)酵初期，乳酸菌大量繁殖，酵母菌同時(shí)促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，抑制了有害微生物的繁殖，減少了發(fā)酵初期植物呼吸作用對(duì)蛋白質(zhì)的水解[26]。ST含量較低的原因可能是加入的乳酸菌數(shù)量充足，大量同型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵前期快速產(chǎn)酸需要消耗能量以維持自身生長(zhǎng)，發(fā)酵過程中更多的ST被利用[27]。乳酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸也抑制了酵母菌等其他微生物的活動(dòng)，使pH維持在低水平下，蛋白酶活性受到抑制，從而減少了NH3-N的產(chǎn)生[23]。SS含量降低的主要原因是發(fā)酵期間乳酸菌活動(dòng)旺盛，消耗的SS較多。pH降低的原因是乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸導(dǎo)致酸度增加。羅攖寧等[28]在甜玉米籽青貯中加入乳酸菌后，NH3-N含量顯著降低。王小平等[29]用酵母菌和乳酸菌的復(fù)合菌劑對(duì)玉米青貯發(fā)酵，結(jié)果顯示玉米青貯的CP含量顯著升高，NDF、ADF含量顯著下降。程方等[30]使用黑曲霉和啤酒酵母對(duì)馬鈴薯渣進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯渣的CP含量及蛋白酶、纖維素酶活性均顯著提高，粗纖維(CF)含量顯著降低。王志敬等[31]對(duì)鳳梨渣進(jìn)行青貯發(fā)酵，結(jié)果顯示，與發(fā)酵第0天相比，發(fā)酵后的鳳梨渣NH3-N含量顯著上升，SS含量、pH顯著下降。王平[32]探究了乳酸菌發(fā)酵對(duì)玉米淀粉的影響，結(jié)果表明發(fā)酵第4天后玉米淀粉含量開始下降。不同研究結(jié)果不一致的原因可能是所用的菌株不同，產(chǎn)酶與產(chǎn)酸的速率不同。因此，可以認(rèn)為復(fù)合益生菌發(fā)酵可以提高飼料的營養(yǎng)水平，降低pH。

3.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵對(duì)飼料中酶活性的影響

隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，乳酸菌不斷生長(zhǎng)，將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖，從而為酵母菌的生長(zhǎng)提供能量，酵母菌大量繁殖，分泌纖維素酶，促進(jìn)了植物纖維素的降解，同時(shí)酵母菌利用乳酸鹽促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)，乳酸菌產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶，促進(jìn)了植物飼料中ST、甘油三酯、肽鏈的水解[33]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵到第5天時(shí)，飼料中的纖維素酶、脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶活性較第0天時(shí)顯著提高，β-淀粉酶活性差異不顯著，但總淀粉酶活性上升，與上述研究結(jié)果相一致，而后期隨著乳酸菌和酵母菌生長(zhǎng)底物的消耗，兩者的生長(zhǎng)緩慢，代謝減慢，分泌的酶減少。由此可以認(rèn)為，復(fù)合益生菌發(fā)酵可以降解飼料中的大分子物質(zhì)，使得飼料更容易被消化吸收。

3.5 復(fù)合益生菌發(fā)酵對(duì)飼料中霉菌毒素含量的影響

飼料在制備的過程中不可避免地會(huì)感染到少數(shù)霉菌，這些霉菌通過代謝會(huì)分泌霉菌毒素，如AFB1、ZEN、DON等，動(dòng)物進(jìn)食被霉菌毒素感染的飼料后健康遭受危害，已有研究表明益生菌發(fā)酵可以降低飼料中霉菌毒素含量[34]。生物吸附是微生物的細(xì)胞壁中的碳水化合物對(duì)毒素進(jìn)行物理以及化學(xué)吸附，微生物發(fā)酵是發(fā)酵所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物通過破壞毒素的結(jié)構(gòu)而使其變成低毒產(chǎn)物，從而達(dá)到安全、穩(wěn)定、脫毒比較徹底的效果[35]。Bovo等[36]使用Lactobacillusrhamnosus吸附處理AFB1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有未被破壞細(xì)胞壁的Lactobacillusrhamnosus對(duì)AFB1有一定吸附能力。Hernandez-Mendoza等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacilluscasei也可以降解AFB1，降解率達(dá)49.2%。劉暢等[38]研究顯示，Saccharomycescerevisiae同樣可以降解AFB1，降解率達(dá)81.16%。Niderkorn等[39]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對(duì)DON有較強(qiáng)的清除能力。Repedkiene等[40]研究顯示，Saccharomycescerevisiae對(duì)DON有良好的吸附能力。趙雪芹等[41]用6種益生菌對(duì)ZEN和DON進(jìn)行了降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pediococcusacidilactici對(duì)ZEN的降解率達(dá)16.32%，對(duì)DON的降解率達(dá)75.51%。Wang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillusrhamnosus和Saccharomycescerevisiae均能降解ZEN，其中Lactobacillusrhamnosus對(duì)ZEN的降解率達(dá)46%。本試驗(yàn)所得結(jié)果顯示，在發(fā)酵第10天時(shí)，AFB1含量降低了73.27%，DON含量降低了59.01%，ZEN含量降低了70.59%，ZEN含量的降低程度高于上述前人研究結(jié)果，AFB1、DON含量的降低程度都在前人研究范圍內(nèi)，對(duì)ZEN含量的降低程度提高可能與本試驗(yàn)中乳酸菌和酵母菌的相互促進(jìn)有關(guān)。綜上可知，復(fù)合益生菌發(fā)酵可以降低飼料中霉菌毒素的含量。

3.6 復(fù)合益生菌發(fā)酵對(duì)飼料有氧穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)其是否發(fā)生腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)，評(píng)價(jià)方法是將發(fā)酵好的飼料暴露在空氣中，通過測(cè)定飼料中心溫度以及環(huán)境溫度，兩者溫度之差達(dá)到2 ℃時(shí)的時(shí)間即為有氧穩(wěn)定的臨界時(shí)間，超過該時(shí)間則發(fā)酵飼料開始腐敗變質(zhì)[43]。同樣，pH也是衡量發(fā)酵飼料有氧穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)[44]。發(fā)酵飼料暴露在空氣中與氧氣充分接觸，導(dǎo)致酵母菌、霉菌等好氧微生物大量增殖，會(huì)引起溫度和pH的異常升高，導(dǎo)致發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性降低[45]。有研究表明，同型發(fā)酵的乳酸菌產(chǎn)生的乙酸過少，導(dǎo)致有氧穩(wěn)定性差。不同的是，異型發(fā)酵的乳酸菌可以產(chǎn)生更多的乙酸，可以抑制好氧發(fā)酵，抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)，而Lactobacillusrhamnosus和Lactobacilluscasei均可以進(jìn)行異型發(fā)酵，從而防止飼料過早的腐敗變質(zhì)，提高發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性。Kleinschmit等[46]對(duì)玉米青貯飼料的有氧穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)沒有添加乳酸菌的玉米青貯飼料的有氧穩(wěn)定臨界時(shí)間為25 h，布氏乳桿菌的添加量達(dá)到105CFU/g后有氧穩(wěn)定臨界時(shí)間為35 h，布氏乳桿菌的添加量超過105CFU/g后，有氧穩(wěn)定臨界時(shí)間達(dá)到503 h。本試驗(yàn)中添加了Lactobacillusrhamnosus和Lactobacilluscasei，并且添加量均超過105CFU/g，其有氧穩(wěn)定臨界時(shí)間為480 h，與上述研究結(jié)果接近。本試驗(yàn)中有氧暴露20～30 d時(shí)，發(fā)酵飼料的pH開始大幅度升高，表明此時(shí)pH出現(xiàn)異常升高，結(jié)合溫度變化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，可知發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定臨界時(shí)間為20 d，說明本試驗(yàn)的復(fù)合益生菌可以提高發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

① 精補(bǔ)料的最優(yōu)發(fā)酵條件：接種量5%，接種比例2∶1、溫度30 ℃、水料比1∶1。該發(fā)酵條件能夠有效提高發(fā)酵飼料中微生物的多樣性，提高Lactobacillusbrevis的相對(duì)豐度。

② 精補(bǔ)料的最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d，該發(fā)酵時(shí)間可提高發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分含量，降低霉菌毒素含量。

③ 發(fā)酵結(jié)束開蓋后，發(fā)酵飼料應(yīng)在20 d內(nèi)喂完。