梅華迪 李袁飛 田 琦 屈圣富 馬現(xiàn)永 李貞明 高鳳仙* 余 苗*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣州510640)

在生豬養(yǎng)殖中，為提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，常采用早期斷奶技術(shù)。然而，仔豬斷奶后，由于環(huán)境和飼糧的改變以及胃腸道發(fā)育不完全，容易造成斷奶應(yīng)激，從而導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、免疫力低下、腸道結(jié)構(gòu)和功能紊亂、腸道微生態(tài)失衡等現(xiàn)象發(fā)生，最終給養(yǎng)豬行業(yè)帶來(lái)巨大損失。定殖于動(dòng)物腸道中的微生物數(shù)量龐大，且具有豐富的生物學(xué)活性，與宿主存在廣泛的互作，對(duì)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫穩(wěn)態(tài)有十分重要的作用[1]。動(dòng)物前腸中未被機(jī)體消化的碳水化合物和蛋白質(zhì)，均可在后腸中作為微生物發(fā)酵的底物，其中碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對(duì)腸道具有益生功能，而蛋白質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的胺類、酚類和吲哚類等產(chǎn)物在高含量時(shí)對(duì)健康有害[2-3]。植物提取物，如黃酮、多酚和精油等，具有提高仔豬生長(zhǎng)性能、促進(jìn)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、調(diào)控腸道微生物區(qū)系、改善腸道發(fā)育、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力等功能[4]。因此，通過在飼糧中添加某些植物提取物可以提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、調(diào)控腸道微生物的組成和改善微生物發(fā)酵模式，以達(dá)到維持腸道健康和調(diào)節(jié)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的目的，最終實(shí)現(xiàn)生豬健康高效養(yǎng)殖。

槲皮素是一種廣泛存在于多種蔬菜和水果中的黃酮類化合物[5]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和維持腸道微生態(tài)平衡的功能。Park等[6]研究證實(shí)，給生長(zhǎng)豬飼喂含有1 000 mg/kg槲皮素的飼糧，可提高其平均日增重(average daily gain，ADG)以及干物質(zhì)和氮表觀消化率。在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加250～1 000 mg/kg的槲皮素可線性和二次項(xiàng)增加其回腸中乳酸桿菌(Lactobacillus)的相對(duì)豐度[7]。在蛋雞飼糧中添加400和600 mg/kg槲皮素可提高其血清總蛋白含量，降低血清尿素氮含量[8]。腸道微生物與機(jī)體的消化、吸收、代謝、免疫等密切相關(guān)，而糞便微生物與腸道微生物的組成、相對(duì)豐度和功能相似，可在一定程度上反映腸道微生物的代謝和腸道健康[9-10]。然而，槲皮素在斷奶仔豬上的應(yīng)用相對(duì)缺乏，且對(duì)其糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的研究也鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探究飼糧中添加不同水平槲皮素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生化指標(biāo)、糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的影響，以期為槲皮素的飼料開發(fā)和斷奶仔豬的綠色健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

槲皮素(純度≥98.5%)購(gòu)自上海某生化科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物、設(shè)計(jì)與飼糧

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)選取144頭健康且體重[(7.45±0.09) kg]相近的21日齡“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬，根據(jù)體重相近原則，隨機(jī)分成3組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭豬。3組分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)、基礎(chǔ)飼糧+200 mg/kg槲皮素(Ⅰ組)和基礎(chǔ)飼糧+400 mg/kg槲皮素(Ⅱ組)?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)營(yíng)養(yǎng)需要配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

仔豬分組后，飼養(yǎng)于溫控密閉豬舍內(nèi)1.2 m×2.1 m大小帶有漏風(fēng)地板的高保育床上，整個(gè)試驗(yàn)期24 d，其中預(yù)試期5 d，正試期19 d。試驗(yàn)期間，所有仔豬自由采食和飲水，按豬舍防疫標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行免疫、消毒和管理。

1.4 樣品采集

正式試驗(yàn)第16～18天，連續(xù)3 d采集各組飼糧和糞便樣品，飼糧以組為單位每次采集100 g；糞便以欄為單位，在每天晨飼前，使用棉簽刺激仔豬肛門排便，每欄(收集至少3頭豬)總共收集約200 g新鮮糞便，去除毛屑后混勻，立即測(cè)定其pH，然后置于-20 ℃冰箱保存，待測(cè)微生物及其代謝產(chǎn)物。

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，禁食4 h后，從每欄中選取體重接近平均體重的1頭豬(共3組，每組8頭豬，一共24頭)，采集10 mL前腔靜脈血，4 ℃冰箱中靜置30 min，然后于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min得到血清，隨后分裝于-80 ℃冰箱保存待用。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能和腹瀉

正式試驗(yàn)期間，每天08:00開始投喂，以欄為單位，記錄每日飼喂量以及每日剩余飼料量，計(jì)算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)。在正式試驗(yàn)第1、19天以及試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天禁食4 h后對(duì)每欄的仔豬進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算ADG、料重比(feed to gain ratio，F(xiàn)/G)。ADFI、ADG、F/G計(jì)算公式如下：

ADFI=每個(gè)重復(fù)正試期總采食量/(正試期
試驗(yàn)天數(shù)×該重復(fù)試驗(yàn)豬頭數(shù))；
ADG=(結(jié)束體重-初始體重)/(正試期試驗(yàn)
天數(shù)×該重復(fù)試驗(yàn)豬頭數(shù))；
F/G=ADFI/ADG。

每天09:00逐只觀察各重復(fù)仔豬的糞便狀況，同時(shí)結(jié)合精神狀態(tài)、肛門有無(wú)紅腫及水樣糞便痕跡等，記錄仔豬腹瀉頭數(shù)和腹瀉評(píng)分，腹瀉指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2[11]。腹瀉率和腹瀉指數(shù)計(jì)算公式如下：

腹瀉率(%)=[每重復(fù)腹瀉仔豬頭數(shù)/
(每重復(fù)仔豬頭數(shù)×天數(shù))]×100；
腹瀉指數(shù)=每重復(fù)仔豬腹瀉評(píng)分之和/
(每重復(fù)仔豬頭數(shù)×天數(shù))。

表2 腹瀉指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

飼糧和糞便中鹽酸不溶灰分含量的測(cè)定參照《飼料中鹽酸不溶灰分的測(cè)定》(GB/T 23742—2009)[12]。鈣、磷和干物質(zhì)含量和能量的測(cè)定參照《飼料分析與檢測(cè)》[13]。粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分含量和能量分別采用脂肪分析儀、全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定、馬弗爐和能量?jī)x進(jìn)行測(cè)定。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率采用內(nèi)源性指示劑鹽酸不溶灰分標(biāo)記法，計(jì)算公式如下：

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=[(飼糧中該營(yíng)養(yǎng)
物質(zhì)含量/飼糧中鹽酸不溶灰分含量-糞便中
該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量/糞便中鹽酸不溶灰分含量)/
(飼糧中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量/飼糧中
鹽酸不溶灰分含量)]×100。

1.5.3 血清生化指標(biāo)

血清生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀(Selectra Pro XL，VITAL公司，荷蘭)測(cè)定，所用試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。

1.5.4 糞便微生物數(shù)量

稱取0.18～0.22 g固體糞便于2 mL離心管，利用糞便DNA純化試劑盒(購(gòu)自杭州新景生物制劑開發(fā)有限公司)分離總DNA，使用核酸蛋白檢測(cè)儀(Nanodrop 1100，Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))測(cè)定DNA濃度和純度，標(biāo)準(zhǔn)為吸光度(OD)260/280：1.80～2.00，OD260/230：2.00左右。采用熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR System，Bio-Rad公司，美國(guó))對(duì)糞便中的總菌、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Lactobacillus、大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)、梭菌簇Ⅳ(Clostridiumcluster Ⅳ)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的16S rRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，計(jì)算結(jié)果均表示為每克糞便中16S rRNA基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值。特異性引物由上海生工基因技術(shù)有限公司合成，引物序列、PCR反應(yīng)體系以及擴(kuò)增程序均參考Yu等[14]的方法。

1.5.5 糞便pH及其微生物代謝產(chǎn)物含量

每個(gè)新鮮糞便樣品混勻后采用pH計(jì)(HI 9024C，HANNA Instruments公司，美國(guó))測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值；根據(jù)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書測(cè)定糞便中乳酸含量；參照Yu等[14]的方法，采用氣相色譜儀(7890B，Agilent Technologies Inc公司，美國(guó))測(cè)定糞便中短鏈脂肪酸含量；參照Chaney等[15]的方法，采用比色法測(cè)定糞便中氨態(tài)氮含量；參照Yang等[16]的方法，采用高效液相色譜儀(e2695，Waters Alliance公司，美國(guó))測(cè)定糞便中生物胺含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，然后通過Tukey’s法進(jìn)行組間多重比較，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉的影響

由表3可知，Ⅱ組的結(jié)束體重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，ADG極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；而Ⅰ組的結(jié)束體重和ADG與對(duì)照組和Ⅱ組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組之間F/G、ADFI、腹瀉率和腹瀉指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 槲皮素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉的影響

2.2 槲皮素對(duì)斷奶仔豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表4可知，Ⅰ組和Ⅱ組的干物質(zhì)表觀消化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，鈣表觀消化率極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，總能表觀消化率有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.088)。Ⅱ組的粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而Ⅰ組的粗蛋白質(zhì)表觀消化率與對(duì)照組和Ⅱ組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組之間粗脂肪、總能、有機(jī)物和磷表觀消化率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 槲皮素對(duì)斷奶仔豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.3 槲皮素對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，Ⅰ組和Ⅱ組的血清總蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，血清球蛋白有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.052)。Ⅱ組的血清尿素氮含量極顯著低于對(duì)照組和Ⅰ組(P<0.01)。各組之間血清白蛋白、葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 槲皮素對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

2.4 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便微生物數(shù)量的影響

由圖1可知，Ⅰ組和Ⅱ組的糞便E.coli數(shù)量顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，糞便Lactobacillus(P=0.055)和Ruminococcus(P=0.086)數(shù)量有高于對(duì)照組的趨勢(shì)。Ⅱ組的糞便Prevotella和Bifidobacterium數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。Ⅱ組的糞便Clostridiumcluster Ⅳ數(shù)量極顯著高于對(duì)照組和Ⅰ組(P<0.01)。各組之間糞便總菌、Firmicutes和Bacteroidetes數(shù)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便pH及乳酸、短鏈脂肪酸含量的影響

由表6可知，Ⅱ組的糞便乳酸含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，乙酸含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，糞便異丁酸和支鏈脂肪酸含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。Ⅱ組的糞便戊酸含量極顯著低于對(duì)照組和Ⅰ組(P<0.01)。Ⅰ組和Ⅱ組的糞便異戊酸含量有低于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.052)。Ⅰ組的糞便乳酸、乙酸和支鏈脂肪酸含量與對(duì)照組和Ⅱ組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組之間糞便pH及丙酸、丁酸、總短鏈脂肪酸含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便pH及乳酸、短鏈脂肪酸含量的影響

2.6 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便生物胺和氨態(tài)氮含量的影響

由表7可知，Ⅰ組和Ⅱ組的糞便腐胺、尸胺和總生物胺含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，糞便色胺(P=0.064)和亞精胺(P=0.052)含量有低于對(duì)照組的趨勢(shì)。各組之間糞便甲胺、酪胺、精胺和氨態(tài)氮含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表7 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便生物胺和氨態(tài)氮含量的影響

2.7 斷奶仔豬糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的PLS-DA

為了更加直觀顯示各組間糞便微生物與其代謝產(chǎn)物的差異，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了PLS-DA。由圖2可知，PLS-DA模型能將各組之間微生物(圖2-A)和代謝產(chǎn)物(圖2-B)明顯區(qū)分開，表明飼糧中添加槲皮素改變了斷奶仔豬糞便微生物數(shù)量和代謝產(chǎn)物組成。

圖2 斷奶仔豬糞便微生物(A)及其代謝產(chǎn)物(B)PLS-DA得分圖

3 討 論

3.1 槲皮素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

諸多研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用。飼糧中添加1 000 mg/kg槲皮素可提高生長(zhǎng)豬的ADG[6]。飼糧中添加25 mg/kg的槲皮素4周后，可提高育肥豬的ADG[17]。在肉雞上的研究同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200、400和800 mg/kg槲皮素，肉雞的ADG分別提高了3.34%、3.22%和2.33%[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著提高斷奶仔豬的ADG和結(jié)束體重。前人研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡[19]，促進(jìn)豬小腸細(xì)胞增殖、分化、更新并維護(hù)腸黏膜屏障的完整性[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素還可提高回腸中營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2、肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和脂肪酸合成酶)基因的表達(dá)，增加回腸抗氧化酶(谷胱甘肽過氧化酶和超氧化物歧化酶1)基因的表達(dá)，改善回腸絨毛高度、寬度及絨隱比[18]。因此，本試驗(yàn)中槲皮素促生長(zhǎng)的原因一方面可能是通過促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡，維持宿主腸道健康，讓宿主更好地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；另一方面可能是通過促進(jìn)腸道發(fā)育，增加腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)提高腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和蛋白質(zhì)合成，最終提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能。

斷奶仔豬飼糧為高蛋白質(zhì)飼糧，且胃腸道發(fā)育不成熟，腸道微生物區(qū)系平衡也尚未建立，會(huì)對(duì)飼糧中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生消化障礙，未消化的蛋白質(zhì)進(jìn)入后腸被細(xì)菌降解成胺類等有害物質(zhì)，易造成仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉[21]，進(jìn)而阻礙仔豬生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)中，飼糧中添加400 mg/kg槲皮素可使仔豬腹瀉率和腹瀉指數(shù)分別降低33.56%和33.33%，而粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高。因此，槲皮素可能通過促進(jìn)仔豬對(duì)蛋白質(zhì)的消化利用，降低仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉。此外，槲皮素在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的抑菌活性，可抑制有害細(xì)菌生物膜的形成，影響其生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝，最終抑制其增殖[22]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)槲皮素的抗菌特性，即槲皮素通過選擇性促進(jìn)有益菌的增殖，同時(shí)抑制有害菌的增殖，進(jìn)而優(yōu)化腸道中的微生態(tài)環(huán)境，從而減少腹瀉的發(fā)生。

3.2 槲皮素對(duì)斷奶仔豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率是反映動(dòng)物對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要指標(biāo)。前人研究表明，飼糧中添加一定劑量的槲皮素可增加畜禽動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。在蛋雞上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著提高其粗蛋白質(zhì)和鈣表觀消化率[23]；在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200 mg/kg的槲皮素可顯著提高其粗蛋白質(zhì)表觀消化率[24]；在生長(zhǎng)豬上的研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添1 000 mg/kg的槲皮素可提高其干物質(zhì)和氮表觀消化率[6]。本研究中，飼糧中添加200和400 mg/kg的槲皮素可顯著提高斷奶仔豬鈣和干物質(zhì)表觀消化率，飼糧中添加400 mg/kg槲皮素還可顯著提高粗蛋白質(zhì)表觀消化率。動(dòng)物對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和利用效率越高，對(duì)其生長(zhǎng)越有利。因此，這一研究結(jié)果正好解釋了本研究飼糧中添加400 mg/kg槲皮素可提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的結(jié)果。前人研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可增加豬腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體和雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，改善豬小腸腸絨毛高度[25-26]。這一研究結(jié)果也正好解釋了飼糧中添加400 mg/kg槲皮素可提高斷奶仔豬粗蛋白質(zhì)表觀消化率的結(jié)果，即槲皮素一方面可能增加了腸道氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)；另一方面可能增加腸上皮接觸面積，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸收與利用，最終改善了粗蛋白質(zhì)表觀消化率。

3.3 槲皮素對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可在一定程度上反映機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收情況。血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量可反映機(jī)體肝臟的代謝情況，血清總蛋白含量升高，說(shuō)明機(jī)體合成蛋白質(zhì)的能力增強(qiáng)，而血清總蛋白由白蛋白和球蛋白組成，這可為機(jī)體進(jìn)一步合成體蛋白提供有利的內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和動(dòng)物的生長(zhǎng)[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加槲皮素可提高蛋雞血清總蛋白含量[8]。在肉雞中也同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加槲皮素可提高血清總蛋白含量[29]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200和400 mg/kg的槲皮素均可顯著提高血清總蛋白含量，表明仔豬蛋白質(zhì)合成代謝增強(qiáng)。血清尿素氮是蛋白質(zhì)水解和氨基酸代謝的終產(chǎn)物之一，其含量可反映飼糧中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)水平和體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝情況，血清尿素氮含量降低，則表明體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和沉積增加，飼糧中蛋白質(zhì)的利用也增加[30]。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著降低血清尿素氮含量，這與劉紅南等[8]在蛋雞和李賢等[29]在肉雞上的研究結(jié)果相似。這表明仔豬在攝取槲皮素之后，機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率得以提高。綜上所述，槲皮素提高血清總蛋白含量的原因可能是通過提高仔豬對(duì)飼糧中蛋白質(zhì)的消化和吸收，使更多的氨基酸進(jìn)入血液；同時(shí)機(jī)體蛋白質(zhì)的分解代謝降低。

總而言之，上述血清生化指標(biāo)的結(jié)果表明，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可增加斷奶仔豬新陳代謝，并提高蛋白質(zhì)沉積，進(jìn)而促進(jìn)了斷奶仔豬的生長(zhǎng)。

3.4 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便微生物數(shù)量的影響

腸道菌群與宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和腸道健康緊密聯(lián)系。糞便微生物與腸道微生物組成、相對(duì)豐度和功能相似，可一定程度反映腸道微生物數(shù)量的變化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著增加蛋雞和肉雞盲腸中Bifidobacterium數(shù)量，同時(shí)降低E.coli數(shù)量[24,31]。本研究結(jié)果表明，斷奶仔豬飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可促進(jìn)糞便中Clostridiumcluster Ⅳ、Prevotella、Bifidobacterium的增殖，抑制E.coli的增殖。同時(shí)，飼糧中添加槲皮素還有增加Lactobacillus和Ruminococcus數(shù)量的趨勢(shì)。Bifidobacterium和Lactobacillus是一種潛在益生菌，一方面通過產(chǎn)生乳酸和乙酸，對(duì)促進(jìn)抗炎和促炎細(xì)胞因子之間的平衡以及腸道健康有積極作用；另一方面它們還可產(chǎn)生抗菌因子，競(jìng)爭(zhēng)性抑制致病菌的增殖，從而維護(hù)宿主腸道健康[32]。Prevotella、Ruminococcus和Clostridiumcluster Ⅳ是降解碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸和調(diào)節(jié)免疫發(fā)育的關(guān)鍵菌群，通過分解這類物質(zhì)產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸，從而促進(jìn)宿主腸黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育，最終對(duì)腸道產(chǎn)生生理保健作用[33-34]。E.coli是條件致病菌，是危害動(dòng)物的主要致病菌之一，被認(rèn)為是誘導(dǎo)豬腹瀉的潛在致病菌[35]，與許多感染和疾病發(fā)生有關(guān)[36]。一個(gè)良好的腸道內(nèi)環(huán)境，不僅可以保持腸道健康，而且能讓宿主更好的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最終改善其生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)中，產(chǎn)乳酸菌和產(chǎn)短鏈脂肪酸菌數(shù)量的增加，以及潛在致病菌數(shù)量的減少，表明槲皮素可通過促進(jìn)有益菌增殖、抑制潛在致病菌增殖來(lái)調(diào)控腸道微生物組成，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而增加宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。這一研究結(jié)果從腸道微生態(tài)方面進(jìn)一步解釋了本研究中的研究結(jié)果，即飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素提高了斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，降低了仔豬腹瀉率。

3.5 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便中微生物發(fā)酵碳水化合物代謝產(chǎn)物的影響

前腸中未被降解的碳水化合物會(huì)由后腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸和乳酸有許多對(duì)機(jī)體健康有益的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可提高人糞便中乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量[37]。體外發(fā)酵試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，槲皮素可促進(jìn)培養(yǎng)基中乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量的升高[38]。本研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著增加仔豬糞便中乳酸和乙酸含量，降低戊酸、異丁酸、異戊酸和支鏈脂肪酸含量。乳酸可減少E.coli定植；乙酸可被腸道吸收進(jìn)入血液，是外周組織能量來(lái)源之一；丁酸是腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，可抑制腫瘤和炎癥發(fā)生[34]。支鏈氨基酸纈氨酸和亮氨酸可由微生物的脫氨作用生成支鏈脂肪酸，是蛋白質(zhì)發(fā)酵的重要指標(biāo)[39]。因此，本試驗(yàn)中碳水化合物代謝產(chǎn)物含量提高和含氮化合物代謝產(chǎn)物含量的降低，表明槲皮素改變了糞便微生物的發(fā)酵模式，使其偏向了碳水化合物發(fā)酵模式，這有利于腸道健康，同時(shí)為宿主生長(zhǎng)提供了更多能量物質(zhì)，最終促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)。

如前所述，飼糧中添加槲皮素增加了主要產(chǎn)乳酸菌Bifidobacterium和Lactobacillu的數(shù)量以及產(chǎn)短鏈脂肪酸菌Prevotella、Ruminococcus和Clostridiumcluster Ⅳ數(shù)量。在豬腸道中，乙酸和乳酸含量與這些菌的數(shù)量存在顯著正相關(guān)關(guān)系[40]。因此，本試驗(yàn)中糞便乳酸和乙酸含量上升可能和產(chǎn)乳酸菌數(shù)量和產(chǎn)短鏈脂肪酸菌數(shù)量增加有關(guān)。

3.6 槲皮素對(duì)斷奶仔豬糞便中微生物發(fā)酵含氮化合物代謝產(chǎn)物的影響

蛋白質(zhì)被動(dòng)物攝入后，在胃腸道中經(jīng)過多種消化酶的作用，分解成小肽和氨基酸，一部分在小腸中被吸收，沿著肝門靜脈進(jìn)入肝臟，在肝臟內(nèi)進(jìn)行分解或合成蛋白質(zhì)，或隨血液分布到各個(gè)組織器官，合成各種特異性的組織蛋白質(zhì)；另一部分未被消化吸收的則進(jìn)入后腸，作為微生物發(fā)酵的底物而被分解代謝。由于小腸和大腸的生理功能以及內(nèi)環(huán)境不同，它們的代謝呈現(xiàn)區(qū)室化特征：小腸中微生物菌群和種類相對(duì)較少，主要進(jìn)行大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如小肽和氨基酸)的消化吸收；大腸中微生物菌群龐大，且食糜在其中的停留時(shí)間較長(zhǎng)，小腸內(nèi)未被消化的蛋白質(zhì)、小肽和氨基酸進(jìn)入大腸，主要被大腸內(nèi)微生物利用。生物胺主要由相應(yīng)氨基酸通過微生物的脫羧作用而形成的[41]。本研究中，飼糧中添加200和400 mg/kg的槲皮素均可顯著降低糞便總生物胺、腐胺和尸胺含量。尸胺和腐胺已被證明對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響，同時(shí)可能作為潛在的腫瘤標(biāo)志物[42]。因此，給斷奶仔豬補(bǔ)充槲皮素后，可減少總生物胺、腐胺和尸胺的產(chǎn)生，這可能是槲皮素改善腸道健康的原因之一。E.coli是一種能代謝含氮化合物產(chǎn)生生物胺的蛋白質(zhì)降解菌[39]。相關(guān)研究表明，糞便腐胺和尸胺含量與E.coli數(shù)量呈顯著正相關(guān)[43]。因此，本試驗(yàn)中，槲皮素降低腐胺和尸胺等含氮化合物含量的其中一個(gè)原因可能是抑制了E.coli的增殖。此外，本研究中，槲皮素顯著增加了飼糧中粗蛋白質(zhì)表觀消化率和提高血清總蛋白含量，表明其可能促進(jìn)了斷奶仔豬前腸對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而減少了氨基酸等含氮物質(zhì)到達(dá)后腸被微生物發(fā)酵產(chǎn)生生物胺等代謝產(chǎn)物的含量。

4 結(jié) 論

飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可提高斷奶仔豬ADG和結(jié)束體重，降低仔豬腹瀉；提高粗蛋白質(zhì)、鈣和干物質(zhì)表觀消化率；調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，增加血清總蛋白含量，降低血清尿素氮含量；同時(shí)調(diào)控?cái)嗄套胸i糞便微生物組成，促進(jìn)有益菌增殖，抑制潛在致病菌增殖；改變糞便中微生物發(fā)酵模式，增加微生物對(duì)碳水化合物的代謝，減少微生物對(duì)含氮化合物的代謝。綜上所述，斷奶仔豬飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素對(duì)腸道乃至整個(gè)機(jī)體健康具有益生作用，從而提高生長(zhǎng)性能。