高靖春 曹舒婷 蔣宗勇 王 麗*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州510225)

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中多采取早期斷奶的手段來(lái)適應(yīng)集約化養(yǎng)殖，但該階段仔豬存在腸道免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全、腸道菌群不穩(wěn)定等因素，使斷奶仔豬易受到外界物理、生物等因素影響而引起腹瀉、生產(chǎn)性能下降，導(dǎo)致腸道屏障功能破壞、腸道通透性增加[1-3]。自我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布禁抗后，探尋綠色安全、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠又便于使用的抗生素替代物來(lái)緩解仔豬斷奶腹瀉成為了當(dāng)前研究的重要方向[4-5]。益生菌制劑是公認(rèn)的比較有效的抗生素替代物之一，是一類(lèi)攝入足夠量時(shí)對(duì)宿主有益的活性微生物[6]。它可以黏附定植在腸道中構(gòu)成微生物屏障，并逐漸形成穩(wěn)定的腸道微生物群落。益生菌群定植可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制有害菌，維持腸道微生態(tài)平衡，而且益生菌及其代謝產(chǎn)物會(huì)影響機(jī)體消化酶的產(chǎn)生，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，進(jìn)而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，因此益生菌被普遍地應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中[7-8]。多項(xiàng)試驗(yàn)表明，斷奶仔豬飼糧中添加益生菌可以降低腹瀉率，增加腸道有益菌群定植，提高緊密連接蛋白表達(dá)，抑制腸道炎癥發(fā)生，改善腸道屏障功能最終緩解腹瀉[9-11]。Meta分析是通過(guò)定量的方法對(duì)多個(gè)同類(lèi)研究結(jié)果進(jìn)行合并匯總，最大程度地利用前人發(fā)表的研究成果，通過(guò)適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型從統(tǒng)計(jì)學(xué)層面綜合地解決爭(zhēng)議和模糊性的結(jié)果，該分析可以實(shí)現(xiàn)增加樣本含量，提高檢驗(yàn)效能的目的，使結(jié)果更具可信度[12-13]。由于益生菌種類(lèi)繁多，添加量及添加方式各不相同，因此以Meta分析的形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析是十分必要的。本研究以Meta分析為手段，針對(duì)腸道屏障相關(guān)指標(biāo)及腹瀉率做出分析，探討益生菌對(duì)斷奶仔豬腹瀉及腸道屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 檢索策略

計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)、維普、Science Direct、Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索年限設(shè)定為從各數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)至2021年4月。中文關(guān)鍵詞包括：仔豬、斷奶仔豬、益生菌，英文關(guān)鍵詞包括：piglets、weaned piglets、probiotics，依據(jù)不同數(shù)據(jù)庫(kù)情況將關(guān)鍵詞進(jìn)行自由組合檢索并收集全部相關(guān)文獻(xiàn)。

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：1)選擇已發(fā)表的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)且研究對(duì)象為健康斷奶仔豬；2)同時(shí)具備對(duì)照組及益生菌組的研究；3)設(shè)定結(jié)果指標(biāo)為①腹瀉率；②空腸絨毛高度、隱窩深度、絨隱比；③回腸絨毛高度、隱窩深度、絨隱比；④腸道緊密連接蛋白表達(dá)，并給出指標(biāo)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差或標(biāo)準(zhǔn)誤。

文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：1)非試驗(yàn)性文章(綜述、會(huì)議文章)、重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)；2)數(shù)據(jù)明顯有誤或數(shù)據(jù)不全等較低質(zhì)量文獻(xiàn)；3)無(wú)對(duì)照組文獻(xiàn)；4)試驗(yàn)組非益生菌添加或與其他藥物、制劑聯(lián)合添加的文獻(xiàn)。

1.2 數(shù)據(jù)提取

全文閱讀后，提取以下數(shù)據(jù)材料進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)：1)文獻(xiàn)第一作者；2)試驗(yàn)組樣本數(shù)、對(duì)照組樣本數(shù)；3)斷奶仔豬品種、試驗(yàn)期；4)給藥途徑、益生菌類(lèi)型、添加量(如研究中出現(xiàn)多個(gè)添加量則先進(jìn)行數(shù)據(jù)合并，后續(xù)進(jìn)行敏感性分析)；5)腸道緊密連接蛋白表達(dá)量、腸道絨毛高度及隱窩深度、腹瀉率。文獻(xiàn)中如有數(shù)據(jù)不全等相關(guān)問(wèn)題通過(guò)電話(huà)及郵件聯(lián)系作者獲取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用R 3.6.3與R Studio 1.2.1335進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。由于不同研究中的研究時(shí)間、檢測(cè)方法、表達(dá)單位等方面存在差異，選擇標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(standard mean difference，SMD)作為效應(yīng)指標(biāo)。并結(jié)合Q檢驗(yàn)(檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.1)，當(dāng)P<0.1時(shí)表明研究存在異質(zhì)性，反之則具有同質(zhì)性。同時(shí)結(jié)合I2值(0～100%)對(duì)異質(zhì)性大小進(jìn)行定量分析，I2值越大則表明研究間的異質(zhì)性越大。當(dāng)I2值大于推薦標(biāo)準(zhǔn)40%時(shí)應(yīng)采用隨機(jī)效應(yīng)模型(randomized effect model)進(jìn)行Meta分析。在95%置信區(qū)間(95% CI)的設(shè)定上，將0值作為無(wú)效值，當(dāng)分析結(jié)果的95% CI跨越無(wú)效值時(shí)，則表示無(wú)法對(duì)該項(xiàng)研究做出定性結(jié)論結(jié)果分析。

1.4 文獻(xiàn)檢索與篩選

依據(jù)檢索式，檢索的文獻(xiàn)總計(jì)2 058篇，依據(jù)文獻(xiàn)標(biāo)題及摘要排除研究對(duì)象非斷奶仔豬、綜述、非益生菌單獨(dú)干預(yù)文章總計(jì)1 778篇，依據(jù)試驗(yàn)方法及文獻(xiàn)內(nèi)容排除無(wú)結(jié)局指標(biāo)、與納入標(biāo)準(zhǔn)不符、非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)、無(wú)對(duì)照組文獻(xiàn)總計(jì)273篇，最終納入樣本文獻(xiàn)7篇。文獻(xiàn)篩選流程圖如圖1所示。

1.5 納入文獻(xiàn)基本特征

本次Meta分析納入樣本的研究對(duì)象均為斷奶仔豬，總計(jì)樣本量為720頭。試驗(yàn)組為單一或混合益生菌添加，添加方式分別為飼糧添加及懸液灌服，對(duì)照組飼喂無(wú)添加基礎(chǔ)飼糧或灌服等量無(wú)菌水。基本特征信息詳見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌添加對(duì)斷奶仔豬腹瀉率影響的森林圖、敏感性分析及漏斗圖

在納入的文獻(xiàn)中，共有5篇報(bào)道，10項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象432頭)報(bào)道了斷奶仔豬添加益生菌與腹瀉率的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為509.4，I2=98%，自由度(df)=9，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，SMD=-15.15，95% CI為-21.55～-8.76，提示了腹瀉率與納入益生菌間具有相關(guān)性。其結(jié)果的森林圖如2-a所示。將各項(xiàng)研究一次性排除掉后應(yīng)用Meta包中的Metainf命令做敏感性分析，排除各研究結(jié)果后的SMD及其95% CI匯總結(jié)果如圖2-b所示。根據(jù)程序結(jié)果顯示，納入的研究可能是異質(zhì)性的來(lái)源之一。若排除掉Li等[16]的異質(zhì)性較大的研究結(jié)果，余下研究合并在一起時(shí)其SMD值變?yōu)?11.904，95% CI為-17.93～5.88，此時(shí)仍表明腹瀉率與納入益生菌間具有相關(guān)性，表明本項(xiàng)結(jié)局指標(biāo)結(jié)果較穩(wěn)健。因此，根據(jù)最終結(jié)果，試驗(yàn)組腹瀉率低于對(duì)照組，結(jié)果顯示其SMD=-15.15，95% CI為-21.55～8.76。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，并采用trim and filled模型進(jìn)行校正。本研究中，在應(yīng)用漏斗圖評(píng)價(jià)法時(shí)，所納入文獻(xiàn)的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)為≥8篇，其漏斗圖如圖2-c所示。從此漏斗圖可以看出，對(duì)此腹瀉率的Meta分析存在發(fā)表偏倚的可能性，采用Egger線性回歸法后，其P<0.05(t=-9.89,df=8,P<0.000 01)，驗(yàn)證了存在發(fā)表偏倚。故采用剪補(bǔ)法評(píng)價(jià)其所帶來(lái)的影響，并作出校正后的漏斗圖，如圖2-d所示即調(diào)整發(fā)表偏倚后其SMD=-2.635 0，95% CI為-8.19～2.92(z=-0.93,P=0.352)。

2.2 益生菌添加對(duì)斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白表達(dá)量影響的森林圖、敏感性分析及漏斗圖

在納入的文獻(xiàn)中，共有3篇報(bào)道，6項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象608頭)報(bào)道了閉合蛋白(Occludin)的表達(dá)量與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為370.47，I2=99%，df=5，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，SMD=2.59，95% CI為0.68～4.50，提示了Occludin的表達(dá)量與納入益生菌間具有相關(guān)性。其結(jié)果的森林圖如圖3-a所示。將各項(xiàng)研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究結(jié)果后的SMD及其95% CI匯總結(jié)果如圖3-b所示。根據(jù)程序結(jié)果顯示，納入的研究可能是異質(zhì)性的來(lái)源之一。若排除掉Deng等[15]的異質(zhì)性較大的研究結(jié)果，其余各項(xiàng)研究合并在一起時(shí)其SMD值變?yōu)?.884，95% CI為-0.12～3.89。因此，根據(jù)最終結(jié)果，Occludin表達(dá)量與納入益生菌間具有相關(guān)性，其SMD=2.587，95% CI為0.67～4.50。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，漏斗圖如圖3-c所示，其P=0.223 6，大于0.05(t=1.44,df=4)，表示不存在發(fā)表偏倚。

在納入的文獻(xiàn)中，共有3篇報(bào)道，6項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象608頭)報(bào)道了閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)表達(dá)量與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為572.9，I2=99%，df=5，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，SMD=20.83，95% CI為8.84～32.83，提示了ZO-1表達(dá)量與納入益生菌間具有相關(guān)性。其結(jié)果的森林圖如圖4-a所示。將各項(xiàng)研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究結(jié)果后的SMD及其95% CI匯總結(jié)果如圖4-b所示。根據(jù)程序結(jié)果顯示，合并后的P<0.01，表明納入的研究并非是異質(zhì)性的來(lái)源之一。因此，根據(jù)最終結(jié)果，ZO-1表達(dá)量指標(biāo)與納入益生菌間具有相關(guān)性，其SMD=20.834，95% CI為8.84～32.83。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，漏斗圖如圖4-c所示，0.223 6

2.3 益生菌添加對(duì)斷奶仔豬腸道絨毛高度、隱窩深度及絨隱比影響的森林圖、敏感性分析及漏斗圖

在納入的文獻(xiàn)中，共有4篇報(bào)道，4項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象200頭)報(bào)道了空腸腸道絨毛高度與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為94.79，I2=97%，df=3，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，SMD=15.22，95% CI為5.91～24.54，提示了空腸絨毛高度與納入益生菌間具有相關(guān)性。其結(jié)果的森林圖如5-a所示。將各項(xiàng)研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究結(jié)果后的SMD及其95% CI匯總結(jié)果如圖5-b所示。根據(jù)程序結(jié)果顯示，合并后的P<0.01，表明納入的研究并非是異質(zhì)性的來(lái)源之一。因此，根據(jù)最終結(jié)果，空腸絨毛高度與添加益生菌間具有相關(guān)性，其SMD=15.22，95% CI為5.91～24.54。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，漏斗圖如圖5-c所示，0.050 0

在納入的文獻(xiàn)中，共有4項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象200頭)報(bào)道了空腸隱窩深度與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為346.82，I2=99%，自由度df=3，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，SMD=-12.59，95% CI為-29.00～3.82，提示了空腸隱窩深度與納入益生菌間不具有相關(guān)性。其結(jié)果的森林圖如圖6-a所示。共有3項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象180頭)報(bào)道了空腸絨隱比與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為299.55，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示SMD=26.62，95% CI為-5.06～58.31，提示了空腸絨隱比與納入益生菌間不具有相關(guān)性。其結(jié)果森林圖如圖6-b所示。共有3項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象180頭)報(bào)道了回腸絨毛高度與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為332.78，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示SMD=10.59，95% CI為-25.50～46.68，提示回腸絨毛高度與納入益生菌間不具有相關(guān)性。其結(jié)果的森林圖如圖6-c所示。共有3項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象180頭)報(bào)道了回腸隱窩深度與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為318.01，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示SMD=-5.80，95% CI為-25.30～13.70，提示回腸隱窩深度與納入益生菌間不具有相關(guān)性，這可能意味著益生菌不是隱窩深度改善的影響因素。其結(jié)果的森林圖如圖6-d所示；共有3項(xiàng)研究(共有研究對(duì)象180頭)報(bào)道了回腸隱窩深度與添加益生菌的關(guān)系。根據(jù)程序指令及顯示的結(jié)果，其Q值為252.65，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應(yīng)選擇隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)效應(yīng)值進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示SMD=-5.80，95% CI為-25.30～13.70，提示了回腸絨隱比與納入益生菌間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。其結(jié)果的森林圖如圖6-e所示。

3 討 論

斷奶仔豬腹瀉在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中常有發(fā)生，引起斷奶仔豬腹瀉的原因有很多，可分為感染型(如病毒、細(xì)菌等病原體侵害引起的腹瀉)和非感染型(如環(huán)境、飼糧等突然改變導(dǎo)致的腹瀉)[21]，一直以來(lái)抗生素都作為緩解斷奶仔豬腹瀉的主要手段，抗生素濫用導(dǎo)致的藥物殘留、耐藥菌等問(wèn)題嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展，甚至威脅到食品安全和人類(lèi)健康。國(guó)家自2020年起全面禁止畜牧行業(yè)飼用抗生素，這對(duì)仔豬健康養(yǎng)殖也提出了全新的挑戰(zhàn)。因此采用綠色安全、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠又便于使用的營(yíng)養(yǎng)手段來(lái)緩解斷奶仔豬腹瀉成為了重要的研究方向。益生菌制劑是公認(rèn)的比較有效的抗生素替代物之一，是一類(lèi)攝入足夠量時(shí)對(duì)宿主有益的活性微生物[22]。多項(xiàng)研究表明，添加益生菌能夠有效緩解斷奶仔豬腹瀉、提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，還可以改善由病原菌引發(fā)的腸道屏障功能破壞及炎癥反應(yīng)，提高其緊密連接蛋白表達(dá)，緩解腸道通透性提高[23-25]。

小腸是機(jī)體主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收?qǐng)鏊?，腸道絨毛在腸腔內(nèi)處于不斷更新的狀態(tài)，腸道隱窩細(xì)胞的不斷分化促進(jìn)著腸絨毛的更新，維持消化吸收功能的穩(wěn)態(tài)。腸道絨毛高度增高能夠增加腸道與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)間的接觸面積，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[26]。腸道上皮細(xì)胞由多種具備不同功能的細(xì)胞組成，共同構(gòu)成了腸道物理屏障，其中緊密連接蛋白是調(diào)節(jié)這一屏障功能的重要組成部分，緊密連接蛋白表達(dá)量是衡量腸道屏障通透性的重要指標(biāo)[27]。緊密連接蛋白表達(dá)量下降會(huì)引起腸道通透性增加，試驗(yàn)證明部分益生菌產(chǎn)物可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞合成緊密連接蛋白來(lái)減輕腸道炎癥、維護(hù)腸道屏障功能[28]，這與本研究結(jié)果相符合。腸道菌群構(gòu)成了腸道微生物屏障，穩(wěn)定的腸道微生物屏障有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收及腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持。試驗(yàn)表明添加益生菌可以有效提高斷奶仔豬腸道中有益菌豐度，抑制病原菌的定植，緩解病原微生物刺激下的腸道損傷，維護(hù)腸道健康[29-30]。除此之外益生菌還能夠通過(guò)維持腸道內(nèi)偏酸性的pH環(huán)境、刺激消化酶及免疫活性物質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)影響消化吸收及腸道健康。這些都提示益生菌能保護(hù)腸道健康[31]，這與本研究中益生菌緩解了斷奶仔豬腹瀉的結(jié)果相吻合。

本研究表明，添加益生菌可以有效降低斷奶仔豬腹瀉率，提高空腸段緊密連接蛋白表達(dá)及空腸絨毛高度，但益生菌對(duì)空腸及回腸隱窩深度及絨隱比的影響并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)論可為解決斷奶仔豬生產(chǎn)過(guò)程中的腸道健康問(wèn)題提供參考依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性：1)納入研究樣本量較少；2)樣本間異質(zhì)性較大；3)各項(xiàng)研究之間的種系、飼糧配方、試驗(yàn)周期、益生菌添加量及菌株種類(lèi)等差異較大；4)缺少質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性進(jìn)行客觀驗(yàn)證。這些都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，本研究也需要進(jìn)一步開(kāi)展大樣本、設(shè)計(jì)合理且周期足夠長(zhǎng)的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加益生菌總體上可以有效緩解斷奶仔豬腹瀉，顯著提高腸道緊密連接蛋白表達(dá)及空腸絨毛高度，這表明添加益生菌可以改善仔豬腸道健康、保護(hù)腸屏障功能。該Meta分析對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文章的結(jié)果進(jìn)行合并，從統(tǒng)計(jì)層面為益生菌對(duì)斷奶仔豬腹瀉及腸道屏障功能的影響給予一定的數(shù)據(jù)參考。