榮 華 楊鈺香 王曉雯 嚴(yán) 暉 高 宇 畢保良 史慶超 孔令富*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2．云南省高校高原漁業(yè)資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201；3．內(nèi)江師范學(xué)院，長江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)江641112)

淺色黃姑魚(Nibeacoibor)俗名白奈、金絲，屬于鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃姑魚屬(Nibea)，是我國東南沿海地區(qū)一種重要的海洋產(chǎn)膠魚類和海水養(yǎng)殖品種[1]。淺色黃姑魚具有較大的魚鰾，魚鰾可加工成高檔魚膠，在我國東南沿海地區(qū)，特別是香港、廣東、福建等地具有較大的貿(mào)易規(guī)模[2-3]。魚膠富含膠原蛋白(占干重的60%以上)，營養(yǎng)價值極高，與燕窩、魚翅齊名，系“海洋八珍”之一，又有“海洋人參”之譽(yù)[4]。近年來，隨著人們對魚膠營養(yǎng)和保健價值的認(rèn)識，市場上對魚膠的需求日益旺盛，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2019年全國魚膠產(chǎn)量7 423 t，產(chǎn)值近200億元，且有逐年上漲趨勢。因此，開展淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白代謝的研究，對提高魚膠品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要理論意義和廣闊的市場前景。

膠原蛋白中含有多種人體必需的氨基酸，其代謝副產(chǎn)物參與重要的生命活動，在細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分裂增殖、免疫和抗癌等方面均發(fā)揮著重要作用[5]。目前對膠原蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究比較多，其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)具特點(diǎn)，甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)以三肽形式(Gly-Pro-Y和Gly-X-Hyp，其中X和Y可以是任意的氨基酸)重復(fù)構(gòu)建成前體膠原蛋白多肽鏈[6]。Pro及其衍生物Hyp占膠原蛋白氨基酸總量的25%，對膠原蛋白的合成、結(jié)構(gòu)和機(jī)械力至關(guān)重要[7-8]。據(jù)報道，Pro可以調(diào)控膠原蛋白的合成，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)[9]；特別是機(jī)體處于應(yīng)激、受傷、妊娠或產(chǎn)后等狀態(tài)下，對Pro的要求會急劇增加，且因自身內(nèi)源性合成Pro不足，往往需要在飲食中提供額外的Pro來滿足機(jī)體的需要，如補(bǔ)充Pro的前體氨基酸(精氨酸和鳥氨酸)及其衍生物Hyp，從而增加細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白的沉積，促進(jìn)傷口愈合[10]。有研究指出，魚類內(nèi)源合成的Pro無法滿足魚類最適生長、膠原蛋白合成及飼料效率[6]。由此可見，魚鰾中富含膠原蛋白，Pro作為膠原蛋白合成的底物，但目前鮮有關(guān)于Pro對魚鰾膠原蛋白代謝影響的研究。因此，本試驗(yàn)通過在飼料中梯度添加Pro，探討Pro對淺色黃姑魚膠原蛋白沉積及相關(guān)基因表達(dá)的影響，分析飼料中Pro最適添加量，以期為淺色黃姑魚功能性飼料的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，并為研究膠原蛋白代謝的營養(yǎng)調(diào)控提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)所用飼料以魚粉、晶體氨基酸為主要蛋白質(zhì)源，魚油為主要脂肪源。參考其他魚類Pro需求量[11]，本試驗(yàn)飼料中Pro的添加水平分別為0、5、10、15、20和25 g/kg，用丙氨酸來平衡飼料中的總氨基酸水平，并參照NRC(2011)中大黃魚的營養(yǎng)需求設(shè)計(jì)其他營養(yǎng)成分的含量，飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，飼料氨基酸組成見表2。飼料原料過60目篩，經(jīng)充分徹底混合，用2.5 mm直徑的膨化機(jī)制粒，在自然通風(fēng)環(huán)境中風(fēng)干，干顆粒飼料被密封在塑料袋中，于-20 ℃存儲直至使用。

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 ItemsPro添加水平 Pro supplemental level/(g/kg)0510152025粗蛋白質(zhì) CP47.4547.1047.4547.3847.3047.28粗脂肪 EE10.4510.6810.5210.1810.1510.33粗灰分 Ash6.967.326.587.457.647.14

表2 飼料氨基酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)魚和飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在汕頭大學(xué)海洋生物臨海實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行，淺色黃姑魚購自當(dāng)?shù)氐囊粋€苗種孵化場。試驗(yàn)魚暫養(yǎng)2周(粗蛋白質(zhì)40.0%、粗脂肪10.0%，揭陽通威飼料有限公司，中國)使魚情穩(wěn)定。選取450尾體重為(8.64±0.14) g的試驗(yàn)魚，隨機(jī)平均分入18個網(wǎng)箱(1.0 m×1.0 m×1.5 m，長×寬×深)，每個網(wǎng)箱25尾，以3個網(wǎng)箱(重復(fù))為一組被隨機(jī)分配到6個飼料處理中。試驗(yàn)期8周。飼養(yǎng)期內(nèi)，每天人工飽食投喂2次(07:00和16:30)，觀察并記錄飼料投喂量、魚的健康狀況及環(huán)境變化等。養(yǎng)殖環(huán)境中溫度為23～30 ℃，pH為7.8～8.1，氨氮濃度低于0.05 mg/L，鹽度為31～33 g/L，溶解氧濃度為5.2～6.0 mg/L。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，采用丁香酚(1∶10 000，純度99%，上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司，中國)麻醉，稱重并計(jì)數(shù)，計(jì)算魚的生長和飼料利用率。隨機(jī)選取6尾/網(wǎng)箱測量個體體重、體長，并用于血液樣本的采集。血漿利用含抗凝劑(肝素鈉)的采血管靜脈抽取后，靜置低溫離心(4 000 r/min，10 min，4 ℃)，分離上層淡黃色液體(血漿)，存于-80 ℃直至后續(xù)檢測。經(jīng)采血后的試驗(yàn)魚用于屠宰，取肝臟和魚鰾，存于-20 ℃直至后續(xù)測定膠原蛋白含量和氨基酸組成。另取試驗(yàn)魚6尾/網(wǎng)箱，迅速分離魚鰾組織樣本，置入液氮速凍，后存于-80 ℃直至后續(xù)RNA的提取和基因表達(dá)分析。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能

增重率(WGR,%)=100×[終末體重(g)-
初始體重(g)]/初始體重(g)；
特定生長率(SGR,%/d)=100×[(ln終末
體重(g)-ln初始體重(g)]/試驗(yàn)天數(shù)(d)；
飼料系數(shù)(FCR)=采食量(g)/[終末
體重(g)-初始體重(g)]；
存活率(SR,%)=100×終末魚數(shù)/
初始魚數(shù)；
肥滿度(CF,% g/cm3)=100×體重(g)/
體長(cm)3。

1.4.2 膠原蛋白含量

采用Hyp測定試劑盒(Art. No. A030-2；南京建成生物工程研究所，中國)，按照操作說明書對樣品進(jìn)行前處理。使用Infinite?Pro 200酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)分析樣品，在550 nm波長下測定吸光度，Hyp含量利用標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式計(jì)算得到。Hyp含量在膠原蛋白中相對固定為12.5%，常用Hyp的含量來計(jì)算組織中膠原蛋白含量(AOAC,2002)：

膠原蛋白含量(g/kg)=Hyp含量(g/kg)×8。

1.4.3 氨基酸含量

飼料和魚鰾組織中氨基酸組成采用TSQ-Endura液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Scientific Dionex，美國)，根據(jù)國標(biāo)(GB/T 18246—2000)進(jìn)行測定。首先測得每種氨基酸的單一峰，根據(jù)出峰時間和峰高計(jì)算出峰面積，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(含量為橫軸，峰面積為縱軸)，計(jì)算出單一氨基酸在樣品中的絕對含量。然后根據(jù)樣品處理過程中的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出干物質(zhì)中氨基酸的含量。由于色氨酸在酸水解過程中被破壞，因此，無法測定出色氨酸的數(shù)值。

1.4.4 膠原蛋白代謝相關(guān)基因相對表達(dá)量

魚鰾組織中總RNA提取根據(jù)Trizol(InvitrogenTM，美國)試劑說明書使用氯仿-異丙醇法提取，利用脫氧核糖核酸酶Ⅰ消化去除基因組DNA(TaKaRa，大連)，通過1.2%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠分析確定其完整性和質(zhì)量，利用Nanodrop?ND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop，美國)測定260 nm/280 nm處的吸光度，確定RNA的最終濃度。使用TransScript?One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit(Trans Gen，北京)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，存于-20 ℃直至使用。利用Primer Premier 5.0軟件(Premier Biosoft International,Palo Alto,美國)根據(jù)大黃魚(Larimichthyscrocea)、鱖魚(Sinipercachuatsi)和鱸魚(Micropterussalmoides)等的相關(guān)基因核心序列保守區(qū)設(shè)計(jì)相關(guān)基因的特異性引物，引物均由華大基因(深圳)合成，引物序列見表3。按如下體系配制20.0 μL的實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)混合液：2.0 μL cDNA、6.4 μL DEPC水、10.0 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)和正、反引物各0.8 μL。qRT-PCR反應(yīng)在Roche Light Cycler?480 System(Roche,瑞士)上按如下條件進(jìn)行：95 ℃預(yù)熱30 s，擴(kuò)增按照95 ℃ 5 s、58 ℃ 20 s、72 ℃ 5 s共執(zhí)行40個循環(huán)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s、95 ℃ 5 s、40 ℃ 30 s收集熔解曲線并結(jié)束反應(yīng)。使用ΔΔCt相對量化法[ΔΔCt=每個樣本試驗(yàn)組ΔCt/對照組ΔCt(試驗(yàn)參考)]計(jì)算基因相對表達(dá)量，相對量化的表達(dá)式2-ΔΔCt表示為試驗(yàn)組目標(biāo)基因與對照組內(nèi)參基因(β-肌動蛋白)的相對表達(dá)量。

表3 膠原蛋白代謝相關(guān)基因的qRT-PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0程序進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Tukey法進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”呈現(xiàn)，以P<0.05為差異顯著性水平。采用折線回歸分析方法，以魚鰾膠原蛋白含量為基礎(chǔ)，評價飼料中Pro的最佳添加水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚生長性能的影響

由表4可知，飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚終末體重、增重率、特定生長率、飼料系數(shù)及肥滿度均無顯著影響(P>0.05)；各組淺色黃姑魚存活率均≥90%，且組間無顯著差異(P>0.05)。由此可以看出，試驗(yàn)魚能很好地適應(yīng)試驗(yàn)條件，沒有出現(xiàn)重大疾病。

表4 飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚生長性能的影響

2.2 飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚膠原蛋白含量的影響

由表5可知，淺色黃姑魚血漿游離Hyp含量隨飼料中Pro添加水平的提高而顯著提高(P<0.05)，肝臟Hyp含量以及魚鰾Hyp和膠原蛋白含量均隨飼料中Pro添加水平的提高呈先升高后降低趨勢(P<0.05)，且魚鰾Hyp和膠原蛋白含量在15 g/kg Pro添加組達(dá)到最高值。以魚鰾膠原蛋白含量評價飼料中Pro的最適添加水平，通過折線回歸分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，淺色黃姑魚飼料中Pro最適添加水平為14.88 g/kg。

表5 飼料中添加不同水平的Pro對淺色黃姑魚膠原蛋白含量的影響

圖1 采用折線回歸分析淺色黃姑魚飼料中

2.3 飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚魚鰾中氨基酸組成的影響

由表6可知，淺色黃姑魚魚鰾中有7種氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和丙氨酸)受到飼料中Pro添加水平的顯著影響(P<0.05)，其他氨基酸含量相對穩(wěn)定(P>0.05)。具體表現(xiàn)為：異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量隨著飼料中Pro添加水平的提高而提高，而丙氨酸含量卻隨著飼料中Pro添加水平的提高而降低；另外，賴氨酸和天冬氨酸含量隨著飼料中Pro添加水平的提高先提高后降低，相反，組氨酸含量隨著飼料中Pro添加水平的提高先降低后提高。

表6 飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚魚鰾中氨基酸組成的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.4 飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚膠原蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知，飼料中添加不同水平Pro對淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白基因和脯氨酸羥化酶基因相對表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)。其中，Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(COL1A1)和Ⅰ型膠原蛋白α2鏈(COL1A2)基因相對表達(dá)量隨飼料中Pro添加水平的提高而提高(P<0.05)；3個脯氨酸羥化酶基因中僅脯氨酰4-羥化酶亞基α1(P4HA1)基因相對表達(dá)量受飼料中Pro添加水平的顯著影響，20 g/kg Pro添加組P4HA1基因相對表達(dá)量顯著高于0～15 g/kg Pro添加組(P<0.05)；此外，脯氨酰4-羥化酶亞基α2(P4HA2)和脯氨酰4-羥化酶亞基α3(P4HA3)基因表達(dá)相對穩(wěn)定，不受飼料中Pro添加水平的影響(P>0.05)。

3 討 論

Pro及其衍生物Hyp占膠原蛋白分子總氨基酸含量的23%[8,12]。據(jù)報道，動物機(jī)體內(nèi)源性合成的Pro無法滿足其最適生長、膠原蛋白合成及飼料效率，其中包括魚類[11]。魚鰾富含膠原蛋白，然而，目前有關(guān)魚鰾膠原蛋白的研究鮮有報道，Pro對魚鰾膠原蛋白代謝的作用及其機(jī)制有待探討。本研究旨在探討飼料中添加Pro對淺色黃姑魚生長及膠原蛋白代謝的影響，發(fā)現(xiàn)Pro對淺色黃姑魚生長性能(包括特定生長率、飼料系數(shù)和肥滿度等)的影響不顯著，表明基礎(chǔ)飼料中的Pro水平能滿足魚體的最佳生長。然而，值得注意的是，適量添加Pro顯著提高了魚鰾中膠原蛋白的含量，表明Pro作為膠原蛋白合成的底物某種程度上促進(jìn)了魚鰾膠原蛋白的合成，這較好地印證了Dabrowski等[13]的觀點(diǎn)，也證明內(nèi)源性Pro合成不能滿足許多魚類最大膠原合成的要求，因此必須在其飲食中額外補(bǔ)充Pro。同時，本試驗(yàn)也間接證實(shí)了Karna等[14]的觀點(diǎn)，Pro對膠原蛋白代謝的作用遠(yuǎn)大于其對生長的促進(jìn)作用，且Pro的可用性決定了膠原蛋白生物合成的速率。此外，本研究中淺色黃姑魚血漿游離Hyp含量隨著Pro添加水平的提高顯著升高，這與Kivirikko等[15]的報道相似，因?yàn)镠yp殘基是脯氨酸羥化酶對原膠原蛋白中Pro翻譯后修飾時的產(chǎn)物，所以血漿游離Hyp含量取決于Pro的含量，同時也說明機(jī)體膠原蛋白代謝水平可能隨著Pro的添加而增強(qiáng)。

均衡的飼料氨基酸組成是動物生長和維持機(jī)體氮平衡的關(guān)鍵。Li等[16]報道，機(jī)體氨基酸組成受到飼料氨基酸組成的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，淺色黃姑魚魚鰾中有5種必需氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和苯丙氨酸)和2種非必需氨基酸(天冬氨酸和丙氨酸)含量受到飼料中Pro添加水平的影響。機(jī)體必需氨基酸保留率被認(rèn)為是飼料中氨基酸供應(yīng)情況最敏感的指標(biāo)[17]，因?yàn)槠胶獍被崮Ｊ揭酝獾倪^量必需氨基酸會被用于分解代謝和生產(chǎn)能量，從而降低了該氨基酸的保持效率[18]。氨基酸之間還存在著非常復(fù)雜的相互關(guān)系，不同物種和不同器官對氨基酸代謝的需求和速度也存在顯著差異，如Pro和Hyp、精氨酸和鳥氨酸影響彼此的新陳代謝，因?yàn)檫@些氨基酸的代謝與Pro的代謝途徑有共通之處，Pro在多胺、精氨酸、谷氨酸、Hyp和鳥氨酸的合成中起著重要作用[7]，本研究僅為復(fù)雜的氨基酸代謝及其相互作用提供簡單依據(jù)。

氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的前體分子，還可以作為信號分子介導(dǎo)一系列通路調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮生理功能[19-20]。有研究表明，在復(fù)雜的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)機(jī)制中，Pro在調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞氧化還原反應(yīng)中，以及在鳥氨酸、精氨酸、多胺、谷氨酸代謝和膠原蛋白的合成等方面發(fā)揮著重要作用[21]。膠原蛋白是成纖維細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的正常途徑由氨基酸(主要是甘氨酸和Pro)形成的，其途徑包括氨基酸的活化、肽鏈的產(chǎn)生和翻譯后修飾[6,8]；如Ⅰ型膠原蛋白，它由2條α1和1條α2肽鏈組成，分別由COL1A1和COL1A2基因編碼[22]。據(jù)報道，核糖體上新合成的原膠原多肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，還需要進(jìn)行一系列的羥基化和糖基化修飾，至少受到9種分子伴侶與酶的作用[23]；如脯氨酸羥化酶是催化細(xì)胞內(nèi)特定膠原修飾的主要酶，脯氨酸羥化酶主要有3個α亞基，通過P4HA1、P4HA2和P4HA3基因編碼[24]。目前，關(guān)于Pro對脯氨酰4-羥化酶亞基α基因的影響研究相對較少。因此，我們開展了相關(guān)研究來探討Pro促進(jìn)魚鰾膠原蛋白合成是否與這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pro對淺色黃姑魚魚鰾中COL1A1、COL1A2和P4HA1基因相對表達(dá)量有顯著影響，且均隨著飼料中Pro添加水平的提高而提高。這與Zhang等[25]報道類似，該研究表明，提高飼料Pro水平能夠促進(jìn)大菱鲆肝臟和肌肉中P4HA1基因的表達(dá)，以及增加Pro的羥基化，導(dǎo)致Pro可用性和膠原蛋白的生物合成增加。以上結(jié)果表明，Pro對魚鰾膠原蛋白代謝的影響可能是通過同時調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原蛋白α鏈基因的轉(zhuǎn)錄和Pro的羥基化而介導(dǎo)的。

同一基因數(shù)據(jù)柱標(biāo)記不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

4 結(jié) 論

① 飼料中添加Pro能夠顯著促進(jìn)淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白沉積，而對淺色黃姑魚生長的促進(jìn)作用不顯著，以魚鰾中膠原蛋白含量估算出飼料中Pro的最適添加水平為14.88 g/kg。

② 飼料中添加Pro顯著影響了淺色黃姑魚魚鰾中7種氨基酸的含量，這些氨基酸可能與Pro的內(nèi)源代謝存在某種關(guān)聯(lián)，需要進(jìn)一步研究。

③ 飼料中添加Pro顯著影響了淺色黃姑魚魚鰾中COL1A1、COL1A2和P4HA1基因的相對表達(dá)量，這也許是導(dǎo)致魚鰾中膠原蛋白沉積增加的原因，但還需要進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白表達(dá)及其磷酸化水平等方面深入探討。