王 丹，劉 捷，張細(xì)元，劉 萍，彭罕鳴

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院/武漢市婦幼保健院消化內(nèi)科，武漢 430015）

研究[1]顯示，黃褐毛忍冬提取物中包括梔子苷在內(nèi)的24種可能被吸收的化學(xué)成分可作用于319個(gè)急性肝損傷靶點(diǎn)，可能具有保肝的作用。核因子E2相關(guān)因 子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrinrelated protein-1，Keap1）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）通路在維持氧化還原平衡方面發(fā)揮重要作用，是氧化應(yīng)激相關(guān)疾病防治的重要靶點(diǎn)[2]。本研究將探討梔子苷對(duì)SAP大鼠肝損傷的影響，并初步探討Nrf2/Keap1/ARE通路在其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量200～260 g，購自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（浙）2019-0004。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h光照/12 h黑暗，溫度20～25℃，濕度50%～60%，自由進(jìn)水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑 梔子苷（貨號(hào)：D1773，HPLC≥98%）購自上海寶曼生物科技有限公司；?；悄懰徕c（貨號(hào)：B20918-20 mg，HPLC≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒（貨號(hào)：RS3390-3）購自金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司；大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonydialdehyed，MDA）、內(nèi)毒素、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）酶聯(lián)免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：SBJ-R0008、SBJ-R0007、SBJ-R0392、SBJ R0546、SBJ-R0040）購自南京森貝伽生物科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）ELISA試劑盒（貨號(hào)：GD-E005277866、GD-E0182-76993）購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；兔抗Nrf2、兔抗Keap1、兔抗血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、兔抗GAPDH、山羊抗兔二抗（貨號(hào)：ab62352、ab627828、ab189491、ab128915、ab6721）購自美國abcam。

1.1.3 主要儀器 BX43型顯微鏡購自日本Olympus公司；Stat-Fax 2100型酶標(biāo)儀購自美國Awareness公司；GelDocEZ型凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥 用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、SAP組和梔子苷低、中、高劑量組，每組10只大鼠。大鼠術(shù)前均禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉。將大鼠平臥捆綁于鼠板臺(tái)，腹部備皮、剖腹，向膽胰管內(nèi)以0.2 mL·min-1勻速逆行注入5%牛磺膽酸鈉（1.5 mL·kg-1）制備SAP模型[3]，縫合腹部切口。假手術(shù)組大鼠開腹后輕微翻動(dòng)胰腺組織數(shù)次，并向膽胰管內(nèi)注入等量的生理鹽水后關(guān)腹。所有大鼠手術(shù)清醒后自由取水，單籠飼養(yǎng)。造模后2 h，梔子苷低、中、高劑量組大鼠分別給予12.5 mg·kg-1、25.0 mg·kg-1、50.0 mg·kg-1梔子苷灌胃[4]，假手術(shù)組、SAP組大鼠均灌胃等量的生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本采集 術(shù)后24 h，大鼠腹主動(dòng)脈取血2～5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清保存于-20℃冰箱，用于肝功能指標(biāo)、內(nèi)毒素、氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥指標(biāo)檢測。將大鼠斷頭處死，解剖留取肝組織，用于HE染色及蛋白檢測。

1.2.3 肝組織HE染色 取左側(cè)肝組織，用4%中性福爾馬林固定，脫水、包埋后切成厚度為2 μm的切片，參照HE染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理變化。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)、內(nèi)毒素、肝功能指標(biāo)、炎癥指標(biāo)檢測 使用SOD、MDA、內(nèi)毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒測定血清SOD、MDA、內(nèi)毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α水平，具體步驟按說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定吸光度（optical density，OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出血清SOD、MDA、內(nèi)毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關(guān)蛋白檢測 取右側(cè)肝組織，用手術(shù)剪剪成小塊，用勻漿器充分研磨，加入預(yù)冷的RIPA裂解液冰浴提取總蛋白，BCA法測定提取總蛋白濃度。將蛋白樣品95℃水浴5 min使蛋白變性，取等量蛋白加入上樣緩沖液混勻，隨后在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶封粉閉1.5 h，加入一抗兔抗Nrf2（1:1 000）、兔抗Keap1（1:1 000）、兔抗HO-1（1:500）、兔抗GAPDH（1:2 000），4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次，加入的山羊抗兔二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記，1:2 000），室溫孵育1 h，用TBST清洗3次，加入顯色劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，根據(jù)內(nèi)參GAPDH條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理變化

HE染色顯示，假手術(shù)組肝組織未見明顯病理損傷；SAP組肝組織中肝細(xì)胞體積腫大、形態(tài)不規(guī)則，空泡化嚴(yán)重，存在炎性細(xì)胞浸潤及肝壞死灶；與SAP組相比，梔子苷低、中、高劑量組肝組織病理損傷情況有不同程度地減輕（見圖1）。

圖1 HE染色觀察各組肝組織病理變化（×200）

2.2 各組血清SOD、MDA水平比較

見表1。

表1 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s，n=10） nmol·mL-1

表1 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s，n=10） nmol·mL-1

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 SOD MDA假手術(shù)組 4.28±0.46 1.12±0.14 SAP 組 0.97±0.10# 3.35±0.36#梔子苷低劑量組 2.04±0.19#△ 2.84±0.23#△梔子苷中劑量組 2.59±0.24#△▲ 2.45±0.21#△▲梔子苷高劑量組 3.14±0.25#△▲□ 2.02±0.20#△▲□

2.3 各組血清內(nèi)毒素水平比較

見表2。

表2 各組血清內(nèi)毒素水平比較（±s，n=10）EU·mL-1

表2 各組血清內(nèi)毒素水平比較（±s，n=10）EU·mL-1

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 內(nèi)毒素假手術(shù)組 0.08±0.02 SAP組 0.33±0.05#梔子苷低劑量組 0.26±0.04#△梔子苷中劑量組 0.21±0.04#△▲梔子苷高劑量組 0.14±0.03#△▲□

2.4 各組血清ALT、AST水平比較

見表3。

表3 各組血清ALT、AST水平比較（±s，n=10） U·L-1

表3 各組血清ALT、AST水平比較（±s，n=10） U·L-1

組別 ALT AST假手術(shù)組 42.45±6.36 107.90±10.05 SAP組 385.38±40.74# 523.42±52.17#梔子苷低劑量組 265.42±32.25#△ 378.29±36.72#△梔子苷中劑量組 221.06±27.84#△▲ 314.26±33.25#△▲梔子苷高劑量組 176.47±25.03#△▲□ 259.68±30.68#△▲□

2.5 各組血清IL-1β、TNF-α 水平比較

見表4。

表4 各組血清IL-1β、TNF-α 水平比較（±s，n=10） ng·L-1

表4 各組血清IL-1β、TNF-α 水平比較（±s，n=10） ng·L-1

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α假手術(shù)組 30.32±3.53 38.45±4.62 SAP 組 285.37±20.46# 312.41±25.84#梔子苷低劑量組 226.01±16.48#△ 258.78±22.73#△梔子苷中劑量組 188.85±15.72#△▲ 216.64±20.16#△▲梔子苷高劑量組 143.23±15.24#△▲□ 177.80±20.53#△▲□

2.6 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

見圖2、表5。

圖2 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表5 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10） GAPDH

表5 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10） GAPDH

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Nrf2 Keap1 HO-1假手術(shù)組 0.63±0.05 0.65±0.06 0.88±0.07 SAP 組 0.30±0.04# 0.34±0.03# 0.41±0.04#梔子苷低劑量組 0.38±0.04#△ 0.41±0.04#△ 0.50±0.05#△梔子苷中劑量組 0.45±0.05#△▲ 0.49±0.05#△▲ 0.62±0.05#△▲梔子苷高劑量組 0.54±0.05#△▲□ 0.55±0.06#△▲□ 0.74±0.06#△▲□

3 討論

肝臟是各種因子的主要靶器官及滅活場所，作為胰腺血液回流的第一站，在SAP發(fā)生后最容易受損[5]。研究顯示，SAP的特點(diǎn)是產(chǎn)生并釋放大量炎癥介質(zhì)及活性氧等細(xì)胞因子，可激活肝巨噬細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致肝損傷，降低肝功能，并進(jìn)一步刺激肝臟釋放更多的炎癥介質(zhì)進(jìn)入體循環(huán)，對(duì)全身其他臟器產(chǎn)生損傷[6]。本研究通過逆行膽胰管注射牛黃膽酸鈉制備SAP模型，結(jié)果顯示，SAP組大鼠肝組織中肝細(xì)胞體積、形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，有炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象出現(xiàn)，同時(shí)血清ALT、AST水平顯著升高，提示SAP大鼠已出現(xiàn)肝損傷，且肝功能明顯下降。此外，SAP組大鼠血清SOD水平顯著降低，MDA、內(nèi)毒素、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，提示SAP大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激及抗氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡，存在一定炎癥反應(yīng)，同時(shí)肝組織功能的下降導(dǎo)致內(nèi)毒素未被有效清除，已有大量內(nèi)毒素進(jìn)入體循環(huán)。

炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)是加重SAP并發(fā)臟器損傷的主要因素，以炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)為治療靶點(diǎn)展開治療已成為減輕SAP并發(fā)臟器損傷的重要方向。Li等[7]研究顯示，使用AG490抑制JAK2通路可減輕SAP相關(guān)的肝損傷，該機(jī)制可能與抑制TNF-α、IL-6和IL-18等促炎因子活性有關(guān)。Zhang等[8]研究顯示，在SAP早期誘導(dǎo)HO-1可能通過抑制TNF-α、促進(jìn)IL-10來調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)，并預(yù)防胰腺及肝損傷。Xu等[9]研究表明，大劑量的維生素C可通過Nrf2/NQO1/HO-1途徑抑制氧化應(yīng)激，從而減輕SAP的胰腺損傷。梔子苷主要提取自茜草科植物梔子的果實(shí)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)梔子苷具有抗氧化、抗炎等藥理作用。鄧怒驕等[10]研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷可以減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕酵母多糖引起的大鼠腸黏膜屏障損傷。馬金安等[11]研究顯示，梔子苷可以通過激活PI3K/Akt通路，抑制心肌缺血再灌注后的氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。本研究顯示，低、中、高劑量的梔子苷均能減輕SAP大鼠的肝組織病理損傷，降低大鼠血清ALT、AST、內(nèi)毒素水平，并呈劑量依賴性，提示梔子苷可減輕SAP大鼠肝損傷，提高肝功能，使SAP大鼠體內(nèi)內(nèi)毒素被肝組織有效清除。此外，低、中、高劑量的梔子苷均能顯著提高SAP大鼠血清SOD水平，降低血清MDA、IL-1β、TNF-α水平，提示梔子苷在SAP大鼠體內(nèi)可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎的作用。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在生理?xiàng)l件下被負(fù)調(diào)控因子Keap1結(jié)合，處于滅活狀態(tài)，受到刺激后被Keap1釋放而激活，Nrf2活化后通過結(jié)合ARE轉(zhuǎn)化到細(xì)胞核，啟動(dòng)下游靶基因如HO-1的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。凌林等[12]研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷能改善膿毒癥引起的急性肺損傷，其機(jī)制與激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路，降低組織氧化應(yīng)激、炎癥水平有關(guān)。楊永康等[13]研究顯示，丹參提取物保護(hù)SAP肺損傷大鼠的肺組織，其機(jī)制與激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。本研究顯示，低、中、高劑量的梔子苷均能提高SAP大鼠肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達(dá)水平，提示梔子苷可能通過激活Nrf2/Keap1/ARE通路，降低SAP大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥水平，進(jìn)而減輕SAP大鼠肝組織損傷并提高肝功能，有效清除體內(nèi)的內(nèi)毒素。

綜上所述，梔子苷通過激活Nrf2/Keap1/ARE通路，抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，對(duì)SAP大鼠的肝組織發(fā)揮保護(hù)作用，但后續(xù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證并完善梔子苷保護(hù)SAP大鼠肝組織的相關(guān)通路，為梔子苷治療SAP提供更全面的機(jī)制。