伍韓雪，儲(chǔ)順禮，蘇屹坤，朱炳震，盧倩倩，王景云

（吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院VIP綜合科，長春 130021）

國內(nèi)外關(guān)于氧化石墨烯（graphene oxide，GO）生物性的研究眾多，其中不乏抗菌活性的探討[1-3]，這些研究成果或?qū)镚O成為新一代納米抗菌劑提供更多有力的理論支撐[4]。目前，有報(bào)道[5]氧化石墨烯作為抗菌劑加入到義齒基托樹脂中，但將GO加入到丙烯酸軟襯材料中作為抗菌劑的相關(guān)研究較少。本研究將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GO添加到丙烯酸酯類自凝軟襯材料中，并以白色念珠菌為菌種，探討添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GO軟襯材料的體外抗菌作用，為臨床丙烯酸酯軟襯材料抗菌活性的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

自凝軟襯墊材料（天馳生物科技有限公司）；單層氧化石墨烯（單層片0.2～10 um，厚度1 nm，純度99.9%）（深圳市宏達(dá)昌進(jìn)化科技有限公司）；白色念珠菌（Candidaalbicans，ATCC10231，上海魯微科技有限公司）；沙氏葡萄糖液體（肉湯）培養(yǎng)基（SDB）（杭州微生物）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（杭州微生物）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡；晶屏系列超聲波處理器 fs-100t（上海生析超聲儀器有限公司）；kq-100da 型數(shù)控超聲波清洗器（云南省昆山市超聲儀器有限公司）；冷熱循環(huán)儀（MX15R，PolyScience，美國威爾公司）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；L929細(xì)胞（CTCC），DMEM培養(yǎng)基 （Hyclone），F(xiàn)BS（Hyclone），青鏈雙抗（上海生工），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，IX71），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰科技有限公司），離心機(jī)（德國Eppendorf公司），CCK-8 （碧云天）， 酶標(biāo)檢測儀（Thermo MK3型），傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛Nicolet iS5）。

1.2 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氧化石墨烯軟襯材料的制備

取適量的GO，按GO/軟襯材料的質(zhì)量比（0.00 wt %，0.25 wt %，0.50 wt %，1.00 wt %，2.00 wt %）添加到去離子水中，用電動(dòng)攪拌棒攪拌10 min，得到分布均勻的懸浮液體系；然后使用功率為150 W，頻率為20 kHz的超聲波分散儀繼續(xù)分散30 min后過濾。將得到的濾渣放到溫度為60 ℃，真空度為0.08 MPa的真空干燥箱中干燥24 h，得到分散性較好的填料粉末，然后將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GO加入軟襯C液中超聲分散20 min，使GO在液體中分散均勻；將粉（g）:液（mL）＝2:1均勻混合，加入到預(yù)先定制好的模具中制備出規(guī)格10 mm×10 mm×2 mm（±0.2 mm）的樣品每組9個(gè)，共45個(gè)。為排出所有因素的影響，材料準(zhǔn)備初期，需將所有樣品經(jīng)蒸餾水洗去附著物，再經(jīng)超聲振蕩清洗20 min，最后經(jīng)紫外線正反面分別照射30 min進(jìn)行滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品表征檢測

采用掃描電鏡（SEM）對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行表征檢測，具體取樣方式為每組隨機(jī)取出1個(gè)樣品進(jìn)行噴金標(biāo)記。并通過傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品材料的官能團(tuán)進(jìn)行檢測。

1.4 細(xì)胞毒性檢測

1.4.1 樣品浸提液的制備 各組樣品浸泡于75%酒精并同時(shí)紫外線照射1 h進(jìn)行消毒，根據(jù)GB/T16886.5-2017標(biāo)準(zhǔn)，按培養(yǎng)基體積與試件表面積1 mL:1.25 cm2的比例制成所需液體，每一組分別取3個(gè)樣品，移入24 mL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并經(jīng)過5% CO2培養(yǎng)箱中浸提24 h，最后經(jīng)過細(xì)菌濾器過濾，最終獲得不同組別樣品的浸提液。分為空白對(duì)照組（單純細(xì)胞培養(yǎng)基，無細(xì)胞）；陰性對(duì)照組（細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞）；分別添加0.25 wt %、0.50 wt%、1.00 wt%、2.00 wt% GO的軟襯材料樣品浸提液為實(shí)驗(yàn)組。

1.4.2 細(xì)胞株接種與細(xì)胞株培養(yǎng) 取凍存的L929細(xì)胞，37 ℃快速解凍后，1 200 r·min-1離心5 min，用DMEM培養(yǎng)基清洗 1～2次（因?yàn)樵诶鋬龅倪^程中加入了對(duì)細(xì)胞繁殖生長有害的物質(zhì)），用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后再離心，加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每天換一次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長狀況，長滿后備用。待細(xì)胞長滿后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cells·mL-1，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，96孔板每孔200 μL，在37℃，5% CO2于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后備用，待各組細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后，進(jìn)行CCK8檢測。

1.4.3 CCK-8檢測 換培養(yǎng)液后分別于24 h、48 h、72 h末各取1個(gè)培養(yǎng)板，吸棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，按照CCK-8試劑盒操作說明，向每孔中加入20 uL CCK-8，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)避光孵育3 h。酶標(biāo)儀450 nm波長測出同一時(shí)間點(diǎn)OD 值，用測得的OD值進(jìn)行細(xì)胞生長影響的分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 細(xì)胞死活染色 將材料浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)至72 h后進(jìn)行死活染色，取出鈣黃綠素-AM（Calcein AM solution）和碘化丙啶（PI solution），室溫平衡30 min，在10 mL的PBS中加入5 μL的PI solution和5 μL的Calcein AM solution，渦旋振蕩混勻制成工作液，此時(shí)Calcein AM solution的濃度為2 μm，PI的濃度為8 μm，按照實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞后，用PBS溫和洗滌細(xì)胞3次，加入足量的染色工作液，保證沒過材料，37℃孵育30 min，熒光倒置顯微鏡拍照觀察。

1.5 抗菌性能檢測

1.5.1 實(shí)驗(yàn)菌液制備 在無菌環(huán)境下，將凍干的白色念珠菌凍干菌加入到沙氏培養(yǎng)液中，輕吹幾次，使白色念珠菌均勻的分散在培養(yǎng)液中。取2 mL菌懸液接種于沙氏培養(yǎng)液中，于37℃下培養(yǎng)24 h后用移取100 μL培養(yǎng)菌懸液接種在沙氏培瓊脂培養(yǎng)基上，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。麥?zhǔn)媳葷岱▽鞔陌咨钪榫苽涑蓾舛葹?×107CUF·mL-1的菌懸液，備用。

1.5.2 抗菌率檢測 采用貼膜法對(duì)含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GO的軟襯材料抗菌性能進(jìn)行測試。從每組濃度中取3個(gè)樣品，分別置于15個(gè)滅菌板中，然后均加入200 μL白色念珠菌實(shí)驗(yàn)菌懸液，用聚丙烯薄膜覆蓋，使菌液與樣品均勻接觸。于37℃培養(yǎng)箱24 h，取出后將20 mL無菌生理鹽水加入每組實(shí)驗(yàn)樣品中，在超聲振蕩器上劇烈振蕩1 min，將器皿中的樣品和聚丙烯薄膜清洗徹底，使得洗脫液混合均勻， 然后將其等比例10倍稀釋至1×10-2CUF·mL-1。每濃度取100 μL接種于SDA培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，測量細(xì)菌的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

注：R為抗菌率（%）；A為對(duì)照樣品回收的平均菌數(shù)（CFU /片）；B為抗菌樣品回收的平均菌數(shù)（CFU /片）；抗菌率r≥99%的抗菌樹脂為有較強(qiáng)的抗菌效果

1.6 抗菌持久性的檢測

1.6.1 樣品的制備與分組 根據(jù)抗菌性能的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)軟村材料中GO含量為2.00 wt%時(shí)，其抗菌率最高，可達(dá)99%，因此選擇GO添加量為2.00 wt%的軟襯材料，樣品的制備方法與材料和方法1.2相同。

1.6.2 菌液的配置 菌液的配置方法同1.5.1。

1.6.3 軟襯材料體外老化處理 分為5組，每組6個(gè)。1）空白對(duì)照一組：未添加GO的軟襯材料經(jīng)過紫外線燈照射8 h；2）空白對(duì)照二組：在5～55 ℃的條件下冷熱循環(huán)5 000次老化處理；3）新制備組：未經(jīng)任何處理的抗菌試件；4）實(shí)驗(yàn)一組：紫外線燈照射8 h；5）實(shí)驗(yàn)二組：5～55 ℃的條件下冷熱循環(huán)5 000次。

1.6.4 抗菌率測定 抗菌率檢測同1.5.2。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)兩種方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品表征

2.1.1 樣品表面形貌 用SEM觀察不同組樣品的表面形貌，見圖1。

圖1 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GO的軟襯材料表面形貌觀察（×5000）

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析 由紅外光譜分析可知，5個(gè)樣品在軟襯材料和GO官能團(tuán)如- CH2（2 958 cm-1）、C= O（1 719 cm-1）、C-H（1 449 cm-1）、C-O-C（1 179cm-1）和 C-O（1 072 cm-1）處均有特征峰，各組波形未見明顯差異（P＞ 0.05）（見圖2）。

圖2 氧化石墨烯改性丙烯酸酯類軟襯材料5個(gè)樣品的紅外光譜對(duì)比圖

2.2 體外細(xì)胞毒性

2.2.1 CCK-8檢測結(jié)果 含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GO的義齒軟襯材料體外細(xì)胞毒性（見圖3），在相同的時(shí)間處理里，5種材料浸提液對(duì)于細(xì)胞增殖均無抑制效果。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)稀釋物質(zhì)提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.2.2 活死細(xì)胞染色結(jié)果 通過熒光顯微鏡觀察，各組的L929細(xì)胞存活率均在98%以上（見圖4），各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 軟襯材料的體外細(xì)胞毒性

2.3 樣品的抗菌性檢測

2.3.1 菌落數(shù)計(jì)量和抗菌率檢測 通過對(duì)比各組樣品白色念珠菌的抗菌效果涂片，可以明顯的發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中菌落最多且密集，而各實(shí)驗(yàn)組菌落相對(duì)較少且稀疏（見圖5）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組白色念珠菌的菌落數(shù)均呈現(xiàn)顯著降低（P＜0.01）。1.00 wt%組對(duì)白色念珠菌的抗菌率為93.04%，具有抗菌作用；2.00 wt%組對(duì)白色念珠菌的抗菌率為99.41%，具有強(qiáng)抗菌作用（見表1）。

圖5 各組樣品對(duì)口腔白色念珠菌的抗菌效果

表1 各組樣品對(duì)白色念珠菌的抗菌率（±s）

表1 各組樣品對(duì)白色念珠菌的抗菌率（±s）

注：與對(duì)照組比較，## P＜0.01

組別 GO添加量/wt% 菌落數(shù)/105 CFU·mL-1 抗菌率/%對(duì)照組 0.00 460.001.65 —實(shí)驗(yàn)一組 0.25 136.004.32 70.43##實(shí)驗(yàn)二組 0.50 65.004.32 85.87##實(shí)驗(yàn)三組 1.00 32.005.89 93.04##實(shí)驗(yàn)四組 2.00 2.671.70 99.41##

2.3.2 老化后菌落數(shù)計(jì)量和抗菌率檢測 見表2。

表2 加入2wt%GO的義齒軟襯材料經(jīng)老化處理后對(duì)白色念珠菌作用（±s，n= 6）

表2 加入2wt%GO的義齒軟襯材料經(jīng)老化處理后對(duì)白色念珠菌作用（±s，n= 6）

注：與新制備組比較，# P＜0.05

組別 菌落數(shù)/105 CFU·mL-1 抗菌率/%空白一組 46.002.65 -空白二組 43.001.29 -新制備組 3.001.63 93.48實(shí)驗(yàn)一組 11.001.83 76.09#實(shí)驗(yàn)二組 6.001.29 86.96#

3 討論

石墨烯由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，在超級(jí)電容器、鋰離子電池、太陽能電池、電化學(xué)傳感器、氣體傳感器、透明導(dǎo)電電極、場發(fā)射裝置、電子器件、光催化、能源相關(guān)領(lǐng)域和聚合物基納米復(fù)合材料等各個(gè)研究領(lǐng)域得到了廣泛的研究[6]。GO具有各種反應(yīng)官能團(tuán)，環(huán)氧和酚羥基位于其基面上，羧基位于其邊緣[7]。因此，GO納米片在水中具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和分散能力[8]，從而更易于與聚合物制備成復(fù)合材料。初步研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯基納米材料對(duì)革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌[9]甚至包括真菌病原體[10]均能產(chǎn)生毒性作用，抑制其生長。GO具有邊緣切割效應(yīng)，細(xì)胞包埋能力和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多重抗菌機(jī)制，其抗菌能力相較于石墨烯得到了有效提升[11]，因此其被認(rèn)為是目前最有效的新興納米抗菌材料[4]。

圖6 各組樣品對(duì)口腔白色念珠菌的長期抗菌效果

本實(shí)驗(yàn)采用貼膜法將實(shí)驗(yàn)菌液直接涂抹在軟襯材料表面，模擬臨床中菌斑在軟襯材料表面的沉積的過程。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)白色念珠菌均抑菌作用，且隨軟襯材料中GO含量的增加，抑菌效果增強(qiáng)。Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)，樹脂基質(zhì)添加GO可對(duì)白色念珠菌的生長和粘附起到明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，1 wt%組可稱為“有抗菌作用”，2 wt%組可稱為“有強(qiáng)抗菌作用”，實(shí)驗(yàn)還采用加速老化處理的方法研究了其抗菌效果的持久性。結(jié)果表明，經(jīng)過加速老化處理后，2 wt%GO組相較于未經(jīng)處理的組的抗菌性能略有下降，但仍有較好的抗菌效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)丙烯酸酯義齒軟襯材料中GO含量為2 wt%時(shí)，對(duì)白色念珠菌抗菌效果最好，這對(duì)抗菌義齒進(jìn)一步的研究和開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步和理論的不斷完善，GO義齒軟襯材料終將有望應(yīng)用于臨床，成為一種新型抗菌義齒軟襯材料。本實(shí)驗(yàn)中，隨著GO含量的增加，軟襯材料的顏色逐漸加深，固化時(shí)間延長，黏性變大。本實(shí)驗(yàn)的不足之處，只探討了GO對(duì)浮游態(tài)白色念珠菌的抗菌效果，未對(duì)生物膜狀態(tài)下的抗菌率進(jìn)行探討。今后的研究方向?qū)⒃贕O義齒軟襯材料顏色的改善、抗菌機(jī)理和生物安全性方面展開，為GO義齒軟襯材料早日應(yīng)用于臨床做好充分的準(zhǔn)備。