羅亞丹

(遵義市第一人民醫(yī)院(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)腎內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

狼瘡性腎炎是免疫系統(tǒng)極為常見(jiàn)的危重癥，多以系統(tǒng)性紅斑狼瘡并發(fā)癥的形式出現(xiàn)，主要臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、腎功能不全及其他全身性表現(xiàn)[1]。目前，臨床治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡主要原則是通過(guò)評(píng)估病情活動(dòng)度，給予腎臟功能保護(hù)治療以及腎組織纖維化延緩控制[2]。高遷移率族蛋白B1是一種高度保守的核蛋白，被臨床證實(shí)參與DNA的轉(zhuǎn)錄及修飾等生物學(xué)功能，且具備晚期促炎作用，是研究?jī)r(jià)值極高的炎癥因子[3]。因此，本文分析高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在狼瘡性腎炎(LN)中的促炎表達(dá)及其腎小球系膜細(xì)胞(HMC)增殖機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年3月至2018年2月我院收治的Ⅳ型狼瘡性腎炎患者35例，提取入選者癌旁遠(yuǎn)端正常組織樣本作為對(duì)照組，提取入選者腎組織腎穿樣本為觀察組。入選者年齡為25～54歲，平均年齡(36.20±2.45)歲，男2例，女16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年推薦的系統(tǒng)性紅斑狼瘡及狼瘡性腎炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，即合并腎臟病變，表現(xiàn)為尿蛋白≧0.5 g/24 h或+++，或管型(紅細(xì)胞，血紅蛋白，顆粒管型或混合管型)，同時(shí)具備四條及以上系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)。入選者腎臟損害程度不一，病情分型為Ⅳ型即為硬化性狼瘡性腎炎?；颊呒凹覍僦橥狻?/p>

1.2研究材料 本研究所用材料包括艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司提供的兔抗HMGB1單克隆抗體試劑盒、兔抗IkBα單克隆抗體試劑盒和兔抗p65多克隆抗體試劑盒，上海聯(lián)邁生物工程有限公司提供的SP法免疫組化試劑盒、上海研卉生物科技有限公司提供的EarthOxDylight649-山羊抗兔熒光二抗、艾美捷科技有限公司提供的艾美捷BiovisionBrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒。

1.3樣本分組 (1)組織樣本：取對(duì)照組正常組織、觀察組腎穿樣本進(jìn)行對(duì)照研究。(2)細(xì)胞樣本：以采用重組人HMGB1蛋白刺激HMC細(xì)胞增殖，研究細(xì)胞增殖水平時(shí)，以空白組為對(duì)照樣本，不同刺激濃度組為觀察組，客觀記錄不同刺激時(shí)段細(xì)胞增殖水平；研究蛋白表達(dá)水平時(shí)，以空白組為對(duì)照樣本，不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)為觀察組。

1.4方法 (1)腎組織脫蠟水化：將腎組織進(jìn)行石蠟切片處理并實(shí)施脫蠟水化，具體步驟如下：應(yīng)用二甲苯脫蠟5 min，應(yīng)用濃度為100%的乙醇水化5 min，再用濃度為95%的乙醇水化3 min，上述步驟各實(shí)施兩次，而后依次應(yīng)用濃度為85%、80%、75%的乙醇各水化3 min即可。(2)免疫熒光抗體技術(shù)：取水化標(biāo)本，應(yīng)用枸櫞酸修復(fù)液0.01 mmol·L-1高壓修復(fù)5 min，而后將其放入溫度為37℃的正常山羊血清中密封保存1 h；將抗HMGB1抗體以1∶200的比例進(jìn)行稀釋處理，并滴入標(biāo)本中，置入恒溫箱中過(guò)夜處理，恒溫箱為4℃；以磷酸緩沖鹽溶液0.01 mmol·L-1浸洗三次，5 min/次；將山羊抗兔IgG以1∶200的比例進(jìn)行稀釋處理，維持37℃恒溫避光孵育1 h；應(yīng)用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚反復(fù)染色處理，而后借助熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，可見(jiàn)HMGB1蛋白陽(yáng)性信號(hào)均呈紅色熒光。(3)免疫組織化學(xué)法:取水化標(biāo)本，應(yīng)用濃度為3%的過(guò)氧化氫避光孵育20 min，而后置入枸櫞酸修復(fù)液0.01 mmol·L-1高壓修復(fù)5 min，使其在室溫下自然冷卻；將標(biāo)本放入溫度為37℃的正常山羊血清中密封保存1 h；將IκBα抗體以1∶200的比例進(jìn)行稀釋處理，并滴入標(biāo)本中，置入恒溫箱中過(guò)夜處理，恒溫箱為4℃；恒溫37℃狀態(tài)下各孵育30 min完成二抗、三抗處理，采用二氨基聯(lián)苯胺染色5 min，再用蘇木精染色2 min，而后置入淡氨水中30 s快速返藍(lán)，再應(yīng)用鹽酸酒精分化處理30 s，待達(dá)到透明脫水狀態(tài)，滴入中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片進(jìn)行封片處理。(4)BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)：按照1×105/孔標(biāo)準(zhǔn)將HMC細(xì)胞接種于96孔板，分別應(yīng)用50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1的重組人HMGB1蛋白刺激HMC細(xì)胞，各組分別設(shè)置三個(gè)復(fù)孔；將標(biāo)本置入濃度為5%的二氧化碳37℃恒溫孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)，孵育1 h、3 h、7 h、11 h時(shí)，于復(fù)孔中滴入100μlBrdU參入液，分別于孵育2 h、4 h、8 h、12 h時(shí)收集細(xì)胞，并于復(fù)孔中滴入200μl固定液，在室溫下孵育30 min，而后應(yīng)用WashingBuffer洗滌緩沖液反復(fù)沖洗三次，再經(jīng)復(fù)孔滴入100μl二抗，在室溫下孵育30 min，再次沖洗后，滴入100μl過(guò)氧化物酶底物，在室溫下孵育30 min，此時(shí)可見(jiàn)增殖活躍的細(xì)胞孔呈藍(lán)色變化，而后，經(jīng)復(fù)孔滴入100μl終止液，可見(jiàn)亮黃變化，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)標(biāo)本光密度值。(5)Westernblot法:分別收集經(jīng)重組人HMGB1蛋白刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(0、10、20、30、40、50、60 min)的細(xì)胞，應(yīng)用裂解液分化后，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白水平，而后用熱水煮沸，時(shí)間控制為5 min，以促使標(biāo)本變性。提取樣品50 μg，應(yīng)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離蛋白，而后維持濕潤(rùn)狀態(tài)將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，應(yīng)用濃度為5%的脫脂奶粉在37℃恒溫狀態(tài)下封閉1 h，將IκBα、p65抗體以1∶1 000比例稀釋?zhuān)⒓尤霕?biāo)本中，置入恒溫箱中過(guò)夜處理，恒溫箱為4℃；將用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記過(guò)的二抗以1∶5 000的比例稀釋?zhuān)?7℃恒溫狀態(tài)下孵育2 h。采用Odyssey?Fc雙色紅外激光成像系統(tǒng)觀察顯像，定量分析對(duì)條帶，其中蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的條帶積分光密度值與β-actin條帶積分光密度值的比值。

2 結(jié) 果

2.1統(tǒng)計(jì)兩組HMGB1和IκBα蛋白水平 在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，觀察組HMGB1蛋白紅色細(xì)胞比例與對(duì)照組比較升高明顯(P<0.05)，定位偏向細(xì)胞核。在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，觀察組IκBα蛋白水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組定位均為細(xì)胞質(zhì)。

2.2統(tǒng)計(jì)兩組HMC細(xì)胞增殖情況 分別應(yīng)用100 μg·L-1、200 μg·L-1重組人HMGB1蛋白刺激8 h、12 h后，觀察組HMC細(xì)胞增殖水平明顯升高(P<0.05)，但與對(duì)照組比較差異不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組HMC細(xì)胞增殖情況

2.3統(tǒng)計(jì)兩組IκBα蛋白和p65蛋白水平 在重組人HMGB1刺激10 min及30 min后，觀察組IκBα蛋白水平明顯下降(P<0.05)，在重組人HMGB1刺激40 min鐘后，p65蛋白水平大幅上升(P<0.05)。

3 討 論

臨床研究證實(shí)，HMGB1以炎癥因子的形式參與了諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展如呼吸系統(tǒng)、自身免疫性疾病、腫瘤疾病等[4-5]。隨著HMGB1晚期促炎作用浮出水面，臨床越來(lái)越多的危重醫(yī)學(xué)研究學(xué)者熱衷于HMGB1作用機(jī)制的研究[6]。湯婷[7]曾在研究中指出，“HMGB1不僅可以直接充當(dāng)炎性細(xì)胞因子參與固有免疫應(yīng)答，也可作為內(nèi)源性的免疫佐劑激活抗原遞呈細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展”，并認(rèn)為臨床探究HMGB1與狼瘡性腎炎的內(nèi)在聯(lián)系能夠?yàn)榻沂驹摷膊〉陌l(fā)病過(guò)程提供參考依據(jù)，為靶向治療提供全新思路。

狼瘡性腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最為常見(jiàn)的并發(fā)癥，其主要病理特征即為腎小球細(xì)胞過(guò)度增殖[8-9]。另外，腎小球細(xì)胞增殖已被作為檢驗(yàn)?zāi)I臟病理活動(dòng)指數(shù)的重要參考指標(biāo)[10-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組HMGB1蛋白紅色細(xì)胞比例與對(duì)照組比較升高明顯(P<0.05)，定位偏向細(xì)胞核，表明狼瘡性腎炎患者體內(nèi)HMGB1異常上升，同時(shí)再次證實(shí)HMGB1存在于細(xì)胞核內(nèi)。另外，重組人HMGB1刺激能夠誘導(dǎo)HMC增殖水平升高，提示HMGB1參與狼瘡性腎炎的發(fā)病。在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀察組p65蛋白水平升高明顯，同時(shí)IκBα水平大幅下降(P<0.05)，提示IκBα蛋白可能在某種機(jī)制下被降解。(P<0.05)，正常狀態(tài)下，由IκB和NF-κB構(gòu)成失活三聚體，而一旦IκB被降解，則會(huì)釋放NF-κB，激活其核轉(zhuǎn)錄因子作用。值得一提的是，NF-κB被證實(shí)與免疫性疾病的發(fā)病存在密切聯(lián)系[12-14]，這便提示HMGB1增殖狼瘡性腎炎系膜細(xì)胞作用可能是通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[15-16]。

綜上，以活化NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而加快狼瘡性腎炎患者腎小球系膜細(xì)胞增殖速度可能是高遷移率族蛋白B1促炎機(jī)制的一種表達(dá)形式。