代雅潔， 劉振權， 江 洋， 于 雪， 王淑艷， 湯軼波

(北京中醫(yī)藥大學， 北京 100029)

近年來，缺血性中風(ischemic stroke，IS)的發(fā)病率呈逐年上升，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢[1]，給患者帶來巨大的痛苦，也給社會帶來了沉重的負擔，已經成為當今醫(yī)學亟待解決的一大難題[2，3]。IS是一種由于局部腦組織血流供應不足或中斷而引起相應腦組織大量神經細胞死亡的疾病[4，5]。IS可引起一系列的病理生理變化，包括能量代謝障礙、炎癥反應、興奮性氨基毒性作用、氧化應激、細胞凋亡等[6]，最終導致神經功能障礙[7，8]。目前臨床主要的治療方法是溶栓治療、取栓治療和抗血小板凝集治療，目的是及時有效地清除血栓或栓塞引起的血流阻斷[9]，但這些措施很難有效改善IS病灶形成后的病理損傷。中藥復方對IS的治療有其獨到的作用，如血府逐瘀湯、星蔞承氣湯和補陽還五湯(buyang huanwu decoction，BYHWD)等方劑在動物實驗和臨床治療中都發(fā)揮了良好的療效[10]。通過科學配伍，中藥中的有效成分可以共同發(fā)揮作用，有效干預IS的進展和預后。不同的中藥可以含有相同的成分，不同的成分也可以有相同或不同的作用靶點，因此中藥復方在治療疾病的過程中會形成一個獨特而復雜的網絡。通過這個網絡，能夠分析中藥復方的作用機制，探究中藥復方與疾病的關系，這種研究方法稱為網絡藥理學[11]。

BYHWD出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯》，原方具有補氣活血、活血通絡的功效，是治療氣虛血瘀型中風的經典名方[12]。目前，國內外學者對于BYHWD干預IS的機制探索也已達到分子水平[13，14]，但對于BYHWD治療IS所涉及的作用靶點和信號通路的研究還值得進一步深入。本文立足于網絡藥理學，以BYHWD治療IS的有效入腦成分-作用靶點-信號通路為研究對象，探討B(tài)YHWD治療IS的作用機制，針對網絡藥理學預測到的凋亡通路進行動物實驗驗證。

1 方法

1.1 BYHWD入腦成分的獲取篩選及靶點預測

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//tcmspw.com/index.php)[15]，檢索BYHWD中各味中藥的成分，以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、血腦屏障通透率(BBB)>-0.30[16，17]為限定條件對其進行篩選，獲取入腦成分及其作用的蛋白靶點。通過化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/main/ tcm_introduce.asp)[18]獲取“地龍”的成分信息，借助Swiss數(shù)據(jù)庫(http：//www.swissadme.ch/、http：//www.swisstargetprediction.ch/)[19，20]對地龍的成分進行篩選。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)[21]對獲取的蛋白靶點進行規(guī)范命名。

1.2 IS相關靶點的篩選

以“ischemic stroke”“ischemic brain damage”為關鍵詞，運用DiGSeE數(shù)據(jù)庫(https：//210.107.182.61/geneSearch/)[22]、OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org)[23]、TTD數(shù)據(jù)庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[24]、DRUGBANK 數(shù) 據(jù) 庫(https：//www. drugbank.ca)[25]挖掘IS的相關靶點。利用Venny平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，對檢索出的BYHWD成分靶點和IS相關靶點取交集并繪制韋恩圖，交集靶點被視為BYHWD治療IS的潛在靶點。

1.3 藥物-成分-靶點-疾病可視化網絡構建

將BYHWD的藥物組成、入腦成分以及潛在靶點導入Cytoscape3.7.2[26]軟件，構建BYHWD治療IS “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖(見圖2)。

1.4 潛在靶點蛋白互作網絡構建與KEGG通路的富集分析

將潛在靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[27]構建蛋白互作(protein protein interaction, PPI)網絡，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”(>0.9)，刪除無關聯(lián)的靶點，其他參數(shù)保持默認設置。借助Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/gp/index.html)[28]對潛在靶點進行KEGG通路分析，將分析結果導入微生信在線平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制KEGG富集分析高級氣泡圖。

1.5 動物實驗驗證

成年雄性SD大鼠購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物許可證號SYXK(京)2016-0038。BYHWD購自北京同仁堂藥店；依達拉奉(陽性藥)購自南京先聲東元制藥有限公司(批號80-181203)。將實驗動物分為假手術組、模型組、BYHWD組和依達拉奉組，通過大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型模擬IS，假手術組大鼠僅分離頸總動脈和頸外動脈，不插入線栓。用BYHWD(12.8 g/kg/qd)和依達拉奉(0.6 mg/kg/qd)分別對MCAO大鼠進行干預。術后7 d大鼠麻醉后取腦，將缺血側腦皮質總蛋白提取后使用BCA法測定蛋白濃度，使用10% SDS-PAGE進行電泳，80 V/30 min濃縮膠電泳，120 V/60 min分離膠電泳。電泳結束后80 V恒壓濕轉90 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光法進行曝光，以磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶(phosphorylation extracellular regulated protein kinases，pErk)條帶與總Erk條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量[29，30]。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 BYHWD化學成分的獲取與篩選及靶點預測結果

通過檢索TCMSP和化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫，獲得BYHWD中7味中藥各自對應的有效活性成分共802種，經篩選去重后得到BYHWD共38個入腦成分，其中包括芒柄花素(Formononetin)、黃芩素(Baicalein)、亞麻酸(Linolenic acid)、棕櫚酸(Palmitic acid)等(見表1)。檢索到黃芪(Radix Astragali)成分作用靶點73個，赤芍(Radix Paeoniae Rubra)72個，川芎(Chuanxiong Rhizoma)30個，當歸(Angelicae sinensis Radix)51個，桃仁(Persicae Semen)44個，紅花(Carthami flos)91個，地龍(Pheretima)139個共500個，合并后刪除重復值共得到靶點242個。

表1 BYHWD入腦成分基本信息

2.2 IS相關靶點的篩選結果

從DiGSeE數(shù)據(jù)庫獲取IS相關靶點227個，通過OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到634個相關靶點，TTD數(shù)據(jù)庫14個，Drugbank數(shù)據(jù)庫61個。合并后刪除重復值，最終得到816個IS相關靶點。將其與BYHWD的作用靶點取交集后共獲得60個(見圖1)。

圖1 BYHWD與IS韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖構建結果

通過Cytoscape3.7.2，構建BYHWD治療IS潛在靶點網絡圖(見圖2)。圖中紅色節(jié)點代表IS；粉色節(jié)點代表BYHWD治療IS的潛在靶點；紫色節(jié)點代表BYHWD的藥物組成；黃色節(jié)點代表各種入腦的成分。其中常春藤素(Hederagenin)、豆甾醇(Stigmasterol)、谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)是2味及以上藥物的共有成分。

注：HQ代表黃芪，CX代表川芎，TR代表桃仁，HH代表紅花，CS代表赤芍，DL代表地龍，GY代表共有成分圖2 BYHWD治療IS潛在靶點網絡圖

2.4 潛在靶點PPI網絡構建結果與KEGG通路的富集分析

將潛在靶點導入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，得到BYHWD治療IS的PPI網絡(見圖3)。對潛在靶點進行KEGG通路富集分析，初次富集到122條信號通路，其中P值排名前20的通路基本信息(見表2)。因KEGG富集分析結果排名前20的信號通路大多與癌癥相關，不能充分體現(xiàn)BYHWD治療IS的作用機制，故查閱文獻[31]，在122條具有統(tǒng)計學意義的信號通路中，選取與BYHWD治療IS相關性更高的20條信號通路，作為KEGG富集分析結果并進行展示(見圖4)。根據(jù)KEGG富集結果，繪制系統(tǒng)的BYHWD治療IS的主要信號通路圖(見圖5)。KEGG富集通路主要包括白細胞介素(interleukin, IL)-17信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信號通路、缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products,AGE-RAGE)信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路等。圖5示，MAPK信號通路是主要的差異通路之一，同時還與其他信號通路串擾，共同參與IS的進展。

圖3 BYHWD治療IS的PPI網絡圖

2.5 Western blot法檢測BYHWD對IS后MAPK/Erk信號通路的影響結果

研究表明[32]，IS發(fā)生后中心缺血區(qū)域發(fā)生細胞壞死、半暗帶區(qū)域則出現(xiàn)細胞凋亡。通過調控半暗帶缺血區(qū)相關細胞凋亡信號通路，可以減輕腦缺血損傷[33]。綜合BYHWD治療IS相關的KEGG富集通路結果來看，MAPK信號通路與細胞的生長繁殖和分裂死亡密切相關，值得進一步去探究。

MAPK信號通路主要由P38 MAPK、氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，Jnk)以及Erk3條信號通路組成[34]。其中有研究表明，Erk信號傳導通路可在顱腦外傷、腦缺血/再灌注損傷、滲透壓變化和生理應激等情況下激活，在多種神經系統(tǒng)疾病腦損傷的過程中都發(fā)揮著重要作用[35-38]。

為探索BYHWD在治療IS過程中對細胞凋亡的調控作用，故采用Western blot技術對MAPK/Erk信號通路進行實驗驗證。

表2 KEGG信號通路基本信息(P值排名前20)

圖4 BYHWD治療IS相關的KEGG富集通路氣泡圖

注：紫色節(jié)點代表與BYHWD治療IS相關的靶點，白色節(jié)點代表與IS相關的靶點圖5 BYHWD治療IS的主要信號通路圖

結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠pErk表達顯著升高(P<0.001)，說明IS后激活了MAPK/Erk信號通路；與模型組比較，BYHWD組和依達拉奉組大鼠腦組織中pErk表達明顯降低(P<0.01)，但各組大鼠缺血側腦皮質中總Erk沒有明顯差異(如圖6)。

注：與假手術組比較：***P<0.001；與模型組比較：##P <0.01圖6 BYHWD對IS大鼠缺血側腦皮質MAPK/Erk通路的影響(n=3)

3 討論

血腦屏障(blood brain barrier, BBB)是一種選擇性滲透屏障。一方面BBB允許血液中腦組織所需要的營養(yǎng)物質等通過；另一方面能阻擋有害物質的侵入，從而維持中樞神經系統(tǒng)(central nervous system, CNS)內環(huán)境的穩(wěn)定。但也由于BBB的存在，許多藥物無法或難以穿過BBB，因此在腦內濃度較低，不能充分發(fā)揮治療作用。

BYHWD由黃芪、赤芍、川芎、當歸尾、桃仁、紅花、地龍等7味中藥組成。方中黃芪為補氣要品，大補脾胃之元氣，令氣旺血行，瘀去血通；當歸尾善于活血，且有化瘀而不傷血的特點。川芎、赤芍、桃仁、紅花4味中藥佐助當歸尾活血祛瘀，配以地龍通經活絡，全方合伍共奏補氣活血通絡之功。前期網絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)[39]，BYHWD有效成分可以從多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮治療IS的作用，但其中部分成分相對分子量較大，脂溶性較低，難以透過BBB，這些成分是否能真正在病變組織處發(fā)揮藥理作用還有待商榷。因此，以BYHWD可入腦成分為介入點闡述其治療IS的藥效物質基礎具有更好的科學性。

通過TCMSP和化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫共收集到BYHWD入腦成分38種，涉及黃酮類化合物黃芩素、異黃酮類化合物芒柄花素以及不飽和氨基酸亞麻酸、棕櫚酸等生物活性物質。黃芩素具有很好的抗炎和抗氧化抗凋亡的藥理作用，不僅能夠通過抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白細胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-17、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)9等炎性介質的產生和調節(jié)核因子(nuclear factor-kappa B, NF-κB)信號通路等方式發(fā)揮抗炎作用[40]，還可改善神經功能缺損，減少腦含水量和梗死面積[41]，具有神經保護作用。芒柄花素廣泛存在于黃芪中，具有降血脂、抗炎以及清除自由基的藥理作用，能夠抑制血管平滑肌細胞增殖，改善動脈粥樣硬化病變[42]，對心腦血管具有一定的保護作用[43]。這為BYHWD治療IS提供了新的藥理學基礎。另外，臨床研究[44]發(fā)現(xiàn)，膳食多不飽和脂肪酸能夠降低急性缺血性卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者血清C反應蛋白(c-reactive protein, CRP)及高半胱氨酸(homocysteine, HCY)水平，其藥理學作用還有待進一步研究。

KEGG信號通路富集分析結果涉及IL-17信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信號通路、缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products, AGE-RAGE)信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路和MAPK信號通路等。KEGG信號通路富集分析結果表明，BYHWD能夠介導多條信號通路，從而發(fā)揮治療IS的作用。腦缺血發(fā)生后，固有淋巴細胞首先被激活，繼而通過遞呈抗原激活適應性免疫，IL-17信號通路是中風后固有免疫和適應性免疫之間的橋梁，發(fā)揮著關鍵作用[45]。已有實驗證實，IL-17在MCAO大鼠大腦和外周血循環(huán)中表達明顯升高[46]，下調IL-17的表達，能夠促進中風小鼠海馬神經的生發(fā)[47]，因此抑制IL-17信號通路可能是防治IS的重要途徑。在IS的急性階段，炎癥反應是繼發(fā)性神經元損傷的重要因素[48]，PI3K/Akt信號通路是經典的炎癥通路，在細胞增殖、分化、凋亡過程中都發(fā)生著重要作用[49]。有研究發(fā)現(xiàn)，BYHWD可能通過調控PI3K/Akt通路，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用[50]。HIF-1在缺氧環(huán)境下廣泛存在于人體中，調節(jié)細胞氧平衡，調節(jié)機體對缺氧的反應，并誘導缺氧基因的表達[51]。糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路的激活，將導致晚期糖基化終產物的過量產生進而加重IS[52]；神經活性配體-受體相互作用信號通路是質膜上與細胞內和細胞外信號通路相關的受體配體的集合，在生理上與神經功能密切相關[53]。上述結果表明，BYHWD可以通過調節(jié)炎癥反應、氧化應激等過程，從而達到治療IS的作用。

MAPK超家族廣泛分布于細胞的胞漿內，是引起細胞各種生物學反應的重要信號傳導系統(tǒng)，Erk是其亞家族之一。Erk信號通路在調節(jié)基因轉錄、神經細胞的凋亡和學習記憶功能等方面具有潛在作用[54]。在本實驗中，大鼠IS發(fā)生后，缺血側腦皮質中pErk表達顯著升高，說明Erk通路在IS后開始活化。經BYHWD治療后，大鼠缺血側腦中pErk表達明顯降低，Erk通路受到抑制。

綜上所述，BYHWD中各種成分協(xié)同配伍，其有效化合物成分在通過肝臟代謝后透過BBB作用于不同的靶點和通路，發(fā)揮治療IS的藥理作用。基于本研究網絡分析預測的結果，結合文獻數(shù)據(jù)分析，可以推測BYHWD通過抗炎、抗氧化應激等生物學途徑減少神經細胞凋亡、壞死，減輕腦水腫，改善神經功能損傷；通過參與炎癥反應、氧化應激反應和抗凋亡干預IL-17信號通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路和MAPK信號通路，發(fā)揮神經保護作用，為BYHWD臨床干預IS提供一定的理論依據(jù)。