李龍妹， 王蘇美， 唐 青， 廖桂雅， 吳萬(wàn)垠

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 廣州 510370)

腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的交叉對(duì)話在腫瘤發(fā)展中扮演著重要角色，與中醫(yī)的“整體觀”不謀而合。扶正抗癌方(fuzheng kang-ai decoction, FZKA)正是在中醫(yī)整體觀念和辨證論治的指導(dǎo)下總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼可延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌患者中位疾病無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間以及中位生存時(shí)間[1，2]；基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，扶正抗癌方可抑制細(xì)胞增殖[3-5]，逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，進(jìn)而抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6-8]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥[10]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，誘導(dǎo)TAMs由M2型向M1型極化轉(zhuǎn)變是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要靶點(diǎn)。為此，本文以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞為對(duì)象，檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，并探討其作用分子機(jī)制，進(jìn)一步探明扶正抗癌方治療腫瘤的機(jī)理。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2，用DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)：加入重組白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4, 20 ng·mL-1)，培養(yǎng)48 h。

1.2 藥物、試劑與儀器

扶正抗癌方是廣東省名中醫(yī)吳萬(wàn)垠教授的協(xié)定方，現(xiàn)已制備成顆粒劑。扶正抗癌方組成：太子參15 g，白術(shù)15 g，黃芪30 g，炒薏苡仁30 g，甘草10 g，山慈菇30 g，白花蛇舌草30 g，龍葵30 g，石見穿30 g，八月札30 g，蛇泡簕30 g，莪術(shù)15 g。顆粒劑由廣東一方制藥制備完成，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010版顆粒劑項(xiàng)下常規(guī)項(xiàng)目進(jìn)行質(zhì)量控制。制備步驟：藥材加水浸泡30 min，加熱至沸煎2 h分離煎液，藥渣繼續(xù)加水煎煮合并煎液，低溫減壓濃縮，噴霧干燥制成干粉后壓制成顆粒分裝，每劑分2袋裝，每袋15 g，1 g=10.33 g生藥。本文實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將顆粒加入1640培養(yǎng)基充分震蕩超聲，37 ℃水浴加熱，離心取上清后0.22 μm濾器過(guò)濾制備成20 mg·mL-1母液，4 ℃保存。本文測(cè)定加入扶正抗癌方后培養(yǎng)基的pH值為7.2～7.4，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化，排除扶正抗癌方藥液加入對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的pH值及細(xì)胞滲透壓的影響。

蛋白質(zhì)印跡法iNOS抗體、TGF-β抗體、C/EBP-β抗體(美國(guó)CST公司，貨號(hào)13120 s、3711 s、3087)；流式細(xì)胞術(shù)的熒光CD 206抗體和熒光CD163抗體(美國(guó)BioLegend公司，貨號(hào)141705、155307)；蛋白質(zhì)印跡法CD206(美國(guó)R&D公司，貨號(hào)AF2535)；二抗(美國(guó)Bio-Rad公司，貨號(hào)1706515)；胎牛血清、胰酶(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)10270-106、25200-072)；microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號(hào)MR101-02、Q711-02)；miR155引物及內(nèi)參U6引物、miR155 inhibitor 及nc-inhibitor(廣州銳博生物科技公司)。miR155 inhibitor主要作用序列：5′-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3′，nc-inhibitor主要作用序列：5′-CAGUACUUUUG UGUAGUACAA-3′。

5430R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；ABI7500熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；NovoCyte流式細(xì)胞儀，美國(guó)Agilent公司；ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；1658033型垂直電泳系統(tǒng)及1703940型半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分組

探究扶正抗癌方對(duì)miR155、C/EBP-β mRNA和蛋白、巨噬細(xì)胞表型影響的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)Mφ組(RAW264.7細(xì)胞組)、Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞組)和Mφ+IL-4+FZKA組(給予FZKA作用的M2型巨噬細(xì)胞組)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞加入重組IL-4(20 ng·mL-1)，培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞，接種于六孔板，24 h后分別加入含不同濃度扶正抗癌方培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集樣品行流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)法檢測(cè)，其中流式細(xì)胞術(shù)另設(shè)同型對(duì)照組(Isotype組，RAW264.7細(xì)胞組)，目的是消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。探究miR155模擬物和抑制物對(duì)miR155表達(dá)的影響以及miR155抑制物對(duì)C/EBP-β mRNA表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)nc-mimic組(空轉(zhuǎn)模擬物組)、nc-inhibitor組(空轉(zhuǎn)抑制物組)、miR155-mimic組(轉(zhuǎn)染miR155模擬物組)和miR155-inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR155抑制劑組)：將M2型巨噬細(xì)胞接種于六孔板，24 h后分別將miR155模擬物和抑制物以及相應(yīng)的陰性對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至M2型巨噬細(xì)胞中，48 h后收集樣品行qPCR檢測(cè)。探究miR155抑制劑抑制扶正抗癌方對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)Isotype組、Mφ組、Mφ+IL-4組、Mφ+IL-4+FZKA組、Mφ+IL-4+miR155 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細(xì)胞組)和Mφ+IL-4+miR155 inhibitor+ FZKA組(給予FZKA作用的轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細(xì)胞組)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞加入重組IL-4，培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞，接種于六孔板，24 h后在相應(yīng)組中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR155inhibitor，48 h后在相應(yīng)組中加入含2.0 mg·mL-1扶正抗癌方培養(yǎng)基，24 h后收集樣品行流式細(xì)胞術(shù)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)

收集樣品至流式管離心去上清，PBS緩沖液洗3次，加入相應(yīng)的抗體避光孵育30 min后上機(jī)操作，檢測(cè)巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物CD206和CD163的表達(dá)(抗體稀釋終濃度為1.25 μg/mL)，采用Novo Express軟件分析數(shù)據(jù)并導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集樣品用RNA提取試劑盒提取總的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再分別用相應(yīng)的PCR引物(見表1)和內(nèi)參(U6和GAPDH)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物設(shè)計(jì)

2.4 蛋白質(zhì)印跡法

收集樣品提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體，iNOS、TGF-β、C/EBP-β抗體均按照1∶1000稀釋；ECL化學(xué)發(fā)光法成像，Image Lab顯影并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法

RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，選用廣州銳博生產(chǎn)的riboFECT CP轉(zhuǎn)染。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，以新鮮的完全培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)重懸，接種于六孔板。第2天轉(zhuǎn)染，配制1×CP buffer:以PBS溶液將10×CP buffer稀釋為1×，每個(gè)EP管加入120 μL 1×CP buffer；在EP管中加入inhibitor溶液20 μL/孔，輕輕混勻，室溫孵育10 min；再加入CP reagent, 12 μL/孔輕輕混勻，室溫孵育10 min；取137 μL inhibitor和轉(zhuǎn)染試劑的混合溶液加入含1863 μL培養(yǎng)基的六孔板中輕輕搖勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，再進(jìn)行后續(xù)處理。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 RAW264.7細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的極化

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)iNOS、CD206、TGF-β的蛋白表達(dá)(如圖1表2)；與Mφ組比較，Mφ+IL-4組中iNOS表達(dá)降低，CD206和TGF-β表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD206和CD163的表達(dá)(如圖2表3)；與Mφ組比較，Mφ+ IL-4組中CD206和CD163表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞。

注：A. Mφ組(RAW264.7細(xì)胞組)；B. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞組)圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)蛋白的表達(dá)

表2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)蛋白的表達(dá)

3.2 扶正抗癌方對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD206和CD163的表達(dá)(如圖2)。表3示，與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組(2.0 mg·mL-1)中CD206和CD163的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。qPCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)iNOS、CD206、TGF-β的mRNA和蛋白表達(dá)(如圖3表4)；與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組中iNOS mRNA和蛋白表達(dá)增加，CD206和TGF-β mRNA和蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，加入扶正抗癌方藥液后可逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞的極化且呈濃度依賴性。

注：A. Isotype組(RAW264.7細(xì)胞組)；B. Mφ組(RAW264.7細(xì)胞組)；C. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞組)；D. Mφ+IL-4+FZKA組(給予FZKA作用的M2型巨噬細(xì)胞組)；FZKA為扶正抗癌方圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型標(biāo)志物巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206和CD163表達(dá)比較

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型標(biāo)志物巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206和CD163表達(dá)比較

3.3 扶正抗癌方對(duì)C/EBP-β mRNA和蛋白表達(dá)的影響

qPCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)C/EBP-β mRNA和蛋白的表達(dá)(如圖3表4)；與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組(2.0 mg·mL-1)中C/EBP-β mRNA和蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，扶正抗癌方能夠在基因及蛋白質(zhì)水平呈濃度依賴性，并抑制C/EBP-β的表達(dá)。

注：A. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞組)；B. Mφ+IL-4+FZKA 1.5 mg·mL-1組(給予1.5 mg·mL-1FZKA作用的M2型巨噬細(xì)胞組)；C. Mφ+IL-4+FZKA 2.0 mg·mL-1組(給予2.0 mg·mL-1FZKA作用的M2型巨噬細(xì)胞組)；白細(xì)胞介素-4(IL-4)；FZKA為扶正抗癌方 圖3 扶正抗癌方對(duì)一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)蛋白表達(dá)的影響

表4 扶正抗癌方對(duì)一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)mRNA和蛋白表達(dá)的影響

3.4 扶正抗癌方對(duì)miR155表達(dá)的影響

qPCR檢測(cè)miR155的表達(dá)(如表5)，與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組(1.5, 2.0 mg·mL-1)中miR155表達(dá)增加且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，扶正抗癌方以濃度依賴性促進(jìn)miR155的表達(dá)。

表5 扶正抗癌方對(duì)miR155表達(dá)的影響

3.5 miR155模擬物和抑制物對(duì)M2型巨噬細(xì)胞miR155表達(dá)的影響

qPCR檢測(cè)miR155的表達(dá)(如表6)，與nc-mimic組比較，轉(zhuǎn)染miR155模擬物組(miR155-mimic組)中miR155的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與nc-inhibitor組比較，轉(zhuǎn)染miR155抑制物組(miR155-inhibitor組)中miR155的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，miR155 mimics和inhibitors在M2型巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功。

表6 轉(zhuǎn)染miR155模擬物和抑制物后M2型巨噬細(xì)胞中miR155的表達(dá)

3.6 miR155對(duì)C/EBP-β mRNA表達(dá)的影響

qPCR檢測(cè)miR155的表達(dá)(如表7)，與nc-inhibitor組比較，miR155-inhibitor組C/EBP-β mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，miR155能夠靶向抑制C/EBP-β mRNA的表達(dá)。

表7 miR155對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)mRNA表達(dá)的影響

3.7 miR155 inhibitor抑制扶正抗癌方對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的逆轉(zhuǎn)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD206和CD163的表達(dá)(如圖4表8)，與Mφ組比較，Mφ+IL-4組中CD206和CD163表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞向M2型極化成功；與 Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組中CD206和CD163表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果顯示扶正抗癌方逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞的極化；與Mφ+IL-4+FZKA組比較，Mφ+IL-4+miR155 inhibitor + FZKA組中CD206和CD163表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。結(jié)果顯示，miR155 inhibitor抑制扶正抗癌方對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的逆轉(zhuǎn)。

4 討論

TAMs是位于腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞，由外周血單核細(xì)胞或組織中巨噬細(xì)胞循環(huán)至腫瘤部位分化而成，占腫瘤組織的50%以上[11]。在不同微環(huán)境下，TAMs可分化為M1型或M2型。在惡性腫瘤中，受Th2型細(xì)胞因子調(diào)控，如IL-4、IL-13，TAMs傾向于分化為M2型。臨床研究發(fā)現(xiàn)，高TAMs密度腫瘤患者的無(wú)復(fù)發(fā)存活率及總存活率均顯著低于低TAMs密度患者，表明TAMs是一個(gè)不良預(yù)后因素，可能是一個(gè)潛在的臨床預(yù)后指標(biāo)[12]。

M1型巨噬細(xì)胞的特征之一是表面標(biāo)志物CD80和CD86高表達(dá)，且能夠分泌大量誘導(dǎo)型iNOS、IL-12、IL-23和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等促炎因子，抑制腫瘤增殖并破壞腫瘤血管內(nèi)皮，發(fā)揮抗腫瘤免疫功能[13]。M2型巨噬細(xì)胞特征之一是表面標(biāo)志物CD206和CD163的高表達(dá)，且能夠分泌IL-4、IL-10、TGF-β等抑炎因子，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管生成，發(fā)揮逃脫免疫監(jiān)視功能[14，15]。當(dāng)以IL-4誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD206和CD163表達(dá)增加，同時(shí)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)iNOS表達(dá)降低，TGF-β表達(dá)增加，表明IL-4可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。加入扶正抗癌方后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD206和CD163表達(dá)下降，qPCR和蛋白質(zhì)印跡法分別在基因和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)iNOS表達(dá)增加，TGF-β表達(dá)降低，表明扶正抗癌方可逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞的極化。前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方的主要活性成分為綠原酸、隱綠原酸等。文獻(xiàn)報(bào)道也提示，綠原酸通過(guò)Janus激酶-信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(the janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號(hào)通路抑制肝癌相關(guān)巨噬細(xì)胞M2極化，通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化，進(jìn)而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)等[16，17]，也與本文研究結(jié)果吻合。考慮扶正抗癌方在逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞極化時(shí)有可能綠原酸起重要作用。

注：A. Isotype組(RAW264.7細(xì)胞組)；B. Mφ組(RAW264.7細(xì)胞組)；C. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞組)；D. Mφ+IL-4+FZKA組(給予FZKA作用的M2型巨噬細(xì)胞組)；E.Mφ+IL-4+miR155 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細(xì)胞組)；F. Mφ+IL-4+miR155 inhibitor + FZKA組(給予FZKA作用的轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細(xì)胞組)；FZKA為扶正抗癌方圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型標(biāo)志物巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206和CD163的表達(dá)

表8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型標(biāo)志物巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD)206和CD163的表達(dá)

巨噬細(xì)胞的極化受磷脂酰肌醇3激酶-蘇氨酸激酶(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)、JAK/STAT等多條通路調(diào)控[18]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-β具有調(diào)控細(xì)胞分化、激活巨噬細(xì)胞等作用，在M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，是一類調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2型極化的重要轉(zhuǎn)錄因子[19]。研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方能夠在基因和蛋白層面上抑制C/EBP-β的表達(dá)。miRNAs是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過(guò)與靶基因的3′UTR區(qū)域結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA翻譯，從而抑制靶基因表達(dá)。而研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方能夠促進(jìn)miR155 的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR155與C/EBP-β的關(guān)系，當(dāng)抑制miR155的表達(dá)時(shí)，C/EBP-β mRNA表達(dá)增加，表明miR155 能夠靶向抑制C/EBP-β mRNA的表達(dá)。前人研究也發(fā)現(xiàn)，miR155-5p可靶向調(diào)控 C/EBP-β介導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[20]。最后發(fā)現(xiàn)，miR155 inhibitor能夠抑制扶正抗癌方對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步證明扶正抗癌方通過(guò)miR-155逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞的極化。

綜上，扶正抗癌方可通過(guò)上調(diào)miR155的表達(dá)，進(jìn)而靶向抑制C/EBP-β基因的表達(dá)，并進(jìn)一步通過(guò)下調(diào)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、CD163和TGF-β，上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞的極化。由此看出，扶正抗癌方在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境方面有重要意義，在臨床防治惡性腫瘤方面有重要發(fā)展前景。