劉建鑫， 揭珊珊， 趙雨坤， 張立石， 曾 輝， 馬雅鑾△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院， 北京 100038)

痛風(fēng)屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，具有“走痛攻刺，如風(fēng)之善動”的特點[1]。痛風(fēng)是一種古老的疾病，嚴(yán)重影響人類健康。近年來，我國高尿酸血癥呈上升和年輕化趨勢，患病率為13.3%，痛風(fēng)患病率為1.1%，患病人數(shù)約1466萬[2]。

痛風(fēng)的病因及病理機制十分復(fù)雜，隨著研究的深入，對其的認(rèn)識與治療也在不斷更新[3，4]。因此建立穩(wěn)定的動物模型，有助于痛風(fēng)發(fā)病機制、臨床特點、藥物治療等研究。臨床上，痛風(fēng)好發(fā)于第一跖趾關(guān)節(jié)，也可累及足背、足跟、踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)甚至指和腕等關(guān)節(jié)。目前，踝關(guān)節(jié)內(nèi)注射單鈉尿酸鹽(monosodium urate，MSU)晶體是制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis，AGA)模型最常用的方法[5，6]。AGA小鼠模型由Reber在Coderre發(fā)明的大鼠AGA模型基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，即使用27號針頭的1 mL注射器從小鼠右踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方，垂直穿刺進(jìn)入踝關(guān)節(jié)腔，注入MSU晶體混懸液，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生AGA癥狀[7，8]。然而筆者在實踐中發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)方法造模時研磨不勻的MSU晶體顆粒易堵塞注射器針頭，影響進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)的MSU劑量、1 mL注射器針頭較粗導(dǎo)致操作中易損傷關(guān)節(jié)骨質(zhì)及針孔處MSU晶體外溢，這些因素均影響模型制備的穩(wěn)定性。為解決這些問題筆者對傳統(tǒng)造模方法進(jìn)行了改良，以提供更穩(wěn)定、可靠的AGA小鼠模型。本研究通過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物福利倫理審查委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號2020-023)。

1 材料

1.1 動物

SPF級8周齡C57BL/6雄性小鼠30只，體質(zhì)量(20±2)g，購于中國食品藥品檢定研究院，實驗動物使用許可證號SCXK(京)2017-0005。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級動物房，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫保持(22±2)℃，室內(nèi)濕度(45±5)%，光照時間為12 h/12 h明暗交替。

1.2 主要試劑及儀器

尿酸鈉(ucid acid sodium salt，貨號U2875-25G)，美國Sigma公司；40 μm 細(xì)胞過濾器(貨號352340)，美國Falcon公司；0.3 mL和1 mL注射器(貨號0197和300841)，美國BD公司；離心機(型號TDZ5-WS/TD5A-WS)，長沙湘儀離心機儀器有限公司；游標(biāo)卡尺(型號PD-151)，上海寶工工具有限公司；正置顯微鏡(型號Scope.A1)，德國ZEISS公司；顯微圖像系統(tǒng)(型號DM600B)，德國Leica公司。

2 方法

2.1 MSU晶體制備

根據(jù)Coderre[8]記載方法，稱取800 mg尿酸鈉鹽溶于5 mL l mol/L NaOH中，加入155 mL 無菌的0.9%氯化鈉溶液，加熱煮沸不斷攪拌至完全溶解，自然冷卻后用l mol/L HCL調(diào)pH值至7.2，轉(zhuǎn)移上清至容量瓶中，室溫下過夜。次日離心后收集沉淀即MSU晶體，70 ℃干燥后放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組

30只C57BL/6小鼠采用配對比較法隨機分為傳統(tǒng)方法AGA模型組(1 mL注射器造模)、改良方法AGA模型組(0.3 mL注射器造模)及對照組各10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行小鼠AGA模型制備。

2.3 模型制備方法

參考Reber[7]的造模方法，制備傳統(tǒng)方法AGA模型，研磨MSU晶體，用無菌的0.9%氯化鈉溶液配成MSU晶體混懸液(50 mg·mL-1)，采用傳統(tǒng)27號針頭的1 mL注射器沿小鼠右踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方垂直進(jìn)針穿刺，注射30 μL MSU混懸液至踝關(guān)節(jié)內(nèi)。

制備改良方法AGA模型，研磨MSU晶體，用無菌的0.9%氯化鈉溶液配成MSU晶體混懸液(50 mg·mL-1)，40 μm細(xì)胞過濾器過篩后，采用30號針頭的0.3 mL注射器造模，注射部位及注射劑量同傳統(tǒng)方法。對照組采用0.3 mL注射器，按上述方法注射等體積無菌的0.9%氯化鈉溶液。

2.4 踝關(guān)節(jié)腫脹程度觀察

于造模前和造模后6、12、18、24、48、72、96、120、144、168 h分別用游標(biāo)卡尺測量各組小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑計算腫脹度。計算公式為：踝關(guān)節(jié)腫脹度(mm)=測定點踝關(guān)節(jié)直徑(mm)-造模前踝關(guān)節(jié)直徑(mm)。

2.5 病理檢測

造模7 d后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死小鼠。取右側(cè)足踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛溶液中固定，脫鈣后常規(guī)方法石蠟包埋、切片和HE染色，顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織病理變化。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 MSU晶體制備

研磨后的尿酸鈉鹽(圖1A)制備成MSU晶體，鏡下可見針尖狀MSU晶體聚集成核(圖1B)。

注：A. 研磨后的尿酸鈉鹽；B. 制備的MSU晶體圖1 單鈉尿酸鹽(Monosodium urate，MSU)晶體制備(×50)

3.2 制備小鼠AGA模型

表1圖2示，MSU晶體干燥研磨后呈粉末狀，顯微鏡下可見顆粒大小不均勻。經(jīng)過40 μm細(xì)胞過濾器過篩改良后，MSU晶體顆粒較均勻，小于40 μm，能夠通過0.3 mL注射器針頭(內(nèi)徑0.15 mm)，不造成堵塞。

3.2.1 傳統(tǒng)方法制備AGA模型 采用27號針頭(內(nèi)徑0.25 mm)的1 mL無菌注射器，沿小鼠右踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方垂直進(jìn)針穿刺，注射30 μL研磨但未過40 μm細(xì)胞過濾器的MSU混懸液(50 mg·mL-1)至踝關(guān)節(jié)內(nèi)。使用1 mL注射器吸取MSU混懸液有時會堵塞針孔，穿刺時而發(fā)生卡針，在注射完成退針時會有部分MSU懸浮液漏出(表1圖2)。

表1 2種方法制備小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型比較

注：A. 1 mL注射器(左)和0.3 mL注射器(右)針頭對比；B. 干燥研磨的MSU晶體(×50)；C、D. 傳統(tǒng)方法使用1 mL注射器制備小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型；E.干燥研磨過細(xì)胞過濾器的MSU晶體(×50)；F、G. 改良方法使用0.3 mL注射器制備小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型圖2 傳統(tǒng)和改良方法制備小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型比較

3.2.2 改良方法制備AGA模型 采用30號針頭的0.3 mL注射器注入30 μL研磨，經(jīng)過40 μm細(xì)胞過濾器過篩的相同濃度MSU晶體混懸液。使用0.3 mL注射器吸取研磨過篩后MSU混懸液未堵塞過針孔，穿刺時進(jìn)針順暢，退針時未發(fā)生滲漏(表1圖2 )。

3.3 2種造模方法對小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度影響

圖3、4示，對照組小鼠右踝關(guān)節(jié)輕度腫脹，48 h后腫脹消退并恢復(fù)正常。

注：與對照組比較：**P<0.01；與傳統(tǒng)方法造模組比較：#P<0.05圖3 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度變化

注：A. 對照組；B. 改良方法造模組；C. 傳統(tǒng)方法造模組圖4 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠造模12 h右踝關(guān)節(jié)大體腫脹比較

傳統(tǒng)和改良2種方法造模組小鼠右踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體后6 h均明顯腫脹，造模后12 h腫脹達(dá)到峰值，然后開始逐漸減退，在觀察的6、12、18和24 h，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。48 h后腫脹減退明顯，造模后6 d右踝關(guān)節(jié)恢復(fù)接近造模前狀態(tài)。

2種造模方法制備的模型小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度有明顯不同。與改良方法造模組比較，傳統(tǒng)方法造模組小鼠在6、12、18和24 h右踝關(guān)節(jié)腫脹程度更為顯著(P<0.05)且組內(nèi)差異較大。造模48 h后，2種造模方法引發(fā)的關(guān)節(jié)腫脹程度均逐漸減輕，6 d后右踝關(guān)節(jié)恢復(fù)并接近造模前狀態(tài)。

3.4 2種造模方法對小鼠踝關(guān)節(jié)組織形態(tài)的影響

造模7 d后HE染色可見，對照組小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨光滑完整，未見滑膜組織增生(圖5A)；改良方法造模組小鼠滑膜組織明顯增生，關(guān)節(jié)軟骨平滑完整無損傷(圖5B)；傳統(tǒng)方法造模組小鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜組織顯著增生并侵犯骨質(zhì)，造成骨破壞(圖5C)。

注：A. 對照組；B. 改良方法造模組；C. 傳統(tǒng)方法造模組圖5 HE染色檢測急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠造模7 d后踝關(guān)節(jié)組織病理變化比較(×100)

4 討論

痛風(fēng)屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，其主要病因為脾腎功能失調(diào)，氣血運行失暢；加之感受風(fēng)寒濕邪，濕濁瘀滯內(nèi)阻凝滯關(guān)節(jié)，主要辨證屬寒濕痹阻之證[9]。AGA指痛風(fēng)急性發(fā)作時MSU晶體沉積關(guān)節(jié)腔導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的紅、腫、熱、痛。AGA與尿酸生成或/和代謝過程異常導(dǎo)致的高尿酸血癥直接相關(guān)，伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤和多種炎癥因子的表達(dá)[10，11]。痛風(fēng)是目前最常見的炎癥關(guān)節(jié)病之一，其致病機制尚不清楚且臨床療效不顯著[2]。因此，制備出符合臨床特征、可靠的動物模型，有助于痛風(fēng)病機研究、中醫(yī)藥治療痛風(fēng)療效篩選及藥物作用機制研究。

目前常用的AGA模型制備方法為在大鼠和小鼠關(guān)節(jié)腔注射外源性MSU晶體模仿人類急性痛風(fēng)發(fā)作[5，6]。研究認(rèn)為，AGA的關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在多種免疫細(xì)胞，可引發(fā)一系列的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[10，11]。由于小鼠的免疫細(xì)胞發(fā)育階段表面標(biāo)志物資料比大鼠的相應(yīng)資料更加齊全，因此越來越多的研究選擇采用小鼠建立AGA模型，更有利于AGA發(fā)病機制研究以及抗痛風(fēng)藥物開發(fā)。

MSU晶體是尿酸在人體關(guān)節(jié)腔存在的主要形式。體內(nèi)尿酸沉積形成針尖狀的MSU晶體，大量產(chǎn)生的MSU晶體聚集成核，加重AGA疾病關(guān)節(jié)損傷[12]。因此，直接注射MSU晶體更能模擬AGA的病理過程。實驗研究模擬臨床發(fā)病部位和癥狀體征有多種造模方法，其中由Reber改進(jìn)踝關(guān)節(jié)穿刺注射MSU晶體制作的AGA小鼠模型，易操作且貼近臨床痛風(fēng)的發(fā)病特點，被相關(guān)研究者廣泛采用，成為小鼠AGA模型的經(jīng)典方法[13，14]。課題組采用該造模方法時遇到一些問題，如MSU晶體研磨后顆粒雖然變小但不均勻，采用注射器抽取混懸液有時會發(fā)生MSU晶體顆粒堵塞針頭；1 mL注射器27號針頭(外徑0.41 mm，內(nèi)徑0.20 mm)穿刺入踝關(guān)節(jié)的狹小縫隙內(nèi)易發(fā)生卡針，人為造成踝關(guān)節(jié)破壞；小鼠踝關(guān)節(jié)背側(cè)緣皮膚和皮下脂肪層較薄，穿刺時針尖(27號針尖長度為2.35 mm)可能未完全進(jìn)入踝關(guān)節(jié)腔，可能將部分MSU晶體混懸液注入踝前皮下或體外；27號針頭外徑較粗(0.41 mm)，注射拔針后可能有部分MSU晶體混懸液從注射孔外溢。這些問題提示，造模中進(jìn)入踝關(guān)節(jié)腔的MSU晶體劑量可能不夠準(zhǔn)確，針頭的機械性損傷可能導(dǎo)致踝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性炎癥，影響模型穩(wěn)定性。針對上述問題加以改進(jìn)，MSU晶體研磨并過細(xì)胞過濾器過篩，晶體小于40 μm，能夠順利進(jìn)出注射器針頭；采用30號針頭的0.3 mL注射器(外徑0.31 mm，內(nèi)徑0.15 mm)針頭直徑更為細(xì)小，可充分進(jìn)入小鼠踝關(guān)節(jié)腔隙，避免人為損傷；30號針尖更短(1.55 mm<2.35 mm)、針頭直徑更小(0.31 mm)，針尖能夠完全進(jìn)入踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注射后針孔小，避免造模針孔漏液。結(jié)果證實，傳統(tǒng)方法造模小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度組內(nèi)差異很大，提示進(jìn)入關(guān)節(jié)腔的MSU晶體劑量有所不同；踝關(guān)節(jié)腫脹程度比改良方法更嚴(yán)重，病理可見骨損傷，提示傳統(tǒng)方法造模存在機械損傷。因此，傳統(tǒng)方法制備的AGA模型存在不穩(wěn)定性和非單因素致病，而改良的造模方法制備的模型較均一穩(wěn)定，避免了機械損傷等傳統(tǒng)方法中存在的問題，更符合臨床AGA發(fā)病過程，有利于單一因素疾病機制的研究。

外源的MSU晶體進(jìn)入關(guān)節(jié)后首先激活天然免疫。單核-巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞是參與AGA的主要免疫細(xì)胞，吞噬清除異物同時引發(fā)急性炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)更多免疫細(xì)胞浸潤和炎性因子表達(dá)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，MSU晶體與單核-巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞發(fā)生相互作用，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的大量合成和分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移至關(guān)節(jié)腔，使原有的炎癥進(jìn)一步加重[7]。改良方法制備AGA模型時也觀察到，造模后小鼠踝關(guān)節(jié)快速腫脹，12 h達(dá)到高峰，持續(xù)6～12 h腫脹開始逐漸消退，在造模后6 d踝關(guān)節(jié)腫脹基本恢復(fù)，7 d后的病理檢測觀察到關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生嚴(yán)重，但未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，提示造模7 d后炎癥反應(yīng)消失。AGA臨床屬于自限性疾病，發(fā)作時所引起的關(guān)節(jié)紅腫和劇烈疼痛等癥狀通常在7～10 d后患者自行恢復(fù)緩解。因此，改良方法制備的模型與AGA臨床發(fā)病過程相符合。

本文在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上改良并優(yōu)化小鼠AGA模型制備，避免了傳統(tǒng)造模方法的不穩(wěn)定因素，有利于單一因素疾病機制的研究和抗痛風(fēng)藥物的篩選，期待未來可以進(jìn)行更深入的研究，為痛風(fēng)治療做出貢獻(xiàn)。