宋志偉， 溫雪晨， 孫彩玉， 盛 濤

(1.黑龍江科技大學(xué) 教務(wù)處， 哈爾濱 150022； 2.黑龍江科技大學(xué) 環(huán)境與化工學(xué)院， 哈爾濱 150022)

0 引 言

纖維素類生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源之一，我國是農(nóng)業(yè)大國，纖維素類資源十分豐富，但其日常焚燒及丟棄對環(huán)境造成很多惡劣影響[1]。纖維素類生物質(zhì)的資源化有4個步驟：預(yù)處理、糖化、發(fā)酵及產(chǎn)物的提取，其中預(yù)處理是限制纖維素類生物質(zhì)資源化的瓶頸之一。這是因?yàn)槟举|(zhì)纖維素利用的主要障礙在于覆蓋在纖維素和半纖維素表面致密的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，使得酶水解的表面積非常小[2]，因此，提高纖維素和半纖維素的糖化率，從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中去除或有效分解木質(zhì)素至關(guān)重要。常見的預(yù)處理方式有物理化學(xué)法、物理法、化學(xué)法和生物法。物化預(yù)處理法效率高[3]，但存在著容易造成二次環(huán)境污染、成本高、副產(chǎn)物抑制等問題[4]。與物化預(yù)處理技術(shù)相比，生物預(yù)處理是一種環(huán)境友好的預(yù)處理方法，可以在溫和的條件下破壞秸稈結(jié)構(gòu)，同時能耗更低，流程和設(shè)備更簡單，且不會對環(huán)境產(chǎn)生危害[5]。然而，在以往的生物預(yù)處理過程中，存在木質(zhì)纖維素降解菌大多對于生長環(huán)境有著嚴(yán)格的要求，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高鹽、重金屬、高溫、強(qiáng)輻射、紫外、干旱、高滲等情況下，這些微生物會失去活性，喪失功能等問題，使得降解菌在預(yù)處理過程中不能發(fā)揮最大的降解能力。因此，強(qiáng)化預(yù)處理過程中微生物的抗逆性，增加降解效果變得尤為重要。

筆者將海藻酸鈉作為包埋載體固定化煙曲霉菌CLL，考察固定化細(xì)胞對玉米秸稈預(yù)處理效果的影響，并通過響應(yīng)面模型優(yōu)化固定化條件，為秸稈類纖維素類生物質(zhì)的資源化應(yīng)用提供新型高效的生物預(yù)處理技術(shù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

1.1.1 底物和接種物

底物玉米秸稈采自哈爾濱市黑龍江大學(xué)農(nóng)場，65 ℃ 下烘干至恒重，粉碎過60篩并貯藏備用。煙曲霉菌CLL(A.fumigatusCLL)來自黑龍江科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室，30 ℃ 條件下，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA) 平板固態(tài)培養(yǎng)成熟后，取3塊帶有真菌菌絲體的PDA培養(yǎng)基(直徑約 0.9 cm)在液態(tài)馬丁培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，取菌懸液備用。

1.1.2 纖維素酶

里氏木霉纖維素酶：里氏木霉(DSM768)在黑龍江科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室獲得，并采用液態(tài)發(fā)酵的方式生產(chǎn)和分離了里氏木霉纖維素酶。簡單地說，在溫度29 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min的條件下，利用纖維素產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1.4 g/L的(NH4)2SO4；0.3 g/L的尿素；2.0 g/L的磷酸氫二鉀；0.3 g/L的MgSO4·7H2O；0.3 g/L的氯化鈣；20 g/L的麥麩；5 g/L的豆餅粉；8 g/L的微晶纖維素)培養(yǎng)里氏木霉4 d后，以8 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，收集上清液作為里氏木霉纖維素酶。商用纖維素酶購自Novozymes(1 000 U/g)，由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-D葡萄糖苷酶組成。

1.1.3 固定化煙曲霉菌CLL小球的制備

將海藻酸鈉(Sodium alginate，以下簡稱SA)加熱溶于水，冷卻后與煙曲霉菌CLL菌懸液(菌懸液質(zhì)量濃度為40 g/L)混合均勻，使SA最終質(zhì)量濃度為20～40 g/L，將SA與菌體混合液用針形管滴入50～100 g/L的CaCl2溶液中，固定化7～8 h后濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

1.2 方 法

制備條件的優(yōu)化

通過3因素3水平實(shí)驗(yàn)分析，對載體質(zhì)量濃度(20、30、40 g/L)、交聯(lián)劑質(zhì)量濃度(50、75、100 g/L)和交聯(lián)時間(7、8、9 h)進(jìn)行優(yōu)化，在30 ℃的條件下培養(yǎng)10 d，2 d取樣一次，以木質(zhì)素降解率為響應(yīng)值。

1.2.2 玉米秸稈的預(yù)處理

采用優(yōu)化后的固定化煙曲霉菌CLL(A.fumigatusCLL)小球在液態(tài)條件下(以玉米秸稈底物，底物質(zhì)量濃度為100 g/L)預(yù)處理玉米秸稈24 d，每2 d取樣一次，測定玉米秸稈中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率。

1.2.3 分析方法

木質(zhì)纖維素原料的組成采用ANKOM 自動纖維分析儀測定。 JSM6480型掃描電子顯微鏡測定玉米秸稈的結(jié)構(gòu)。利用雙面膠帶將待表征玉米秸稈樣品固定在銅片上,使用Hummer I真空鍍膜機(jī)在氬氣存在的條件下用Au-Pd為樣品鍍金后，使用SEM(JEOL-JSM 6480 LVSEM at 20 kV)觀察玉米秸稈的表面結(jié)構(gòu)。玉米秸稈官能團(tuán)變化采用 Perkin Elmer Spectrum 100 FT-IR 光譜儀測定。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，均值用標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用配備有 Bio-Rad Aminex HPX-87H 色譜柱和折射率檢測器(RID) 的高效液相色譜 (HPLC) (1260 Infinity, Agilent Technologies, USA) 分析水解產(chǎn)物的成分。柱箱和檢測器的工作溫度分別為 70 ℃和 55 ℃。使用 H2SO4(2 mmol/L) 作為流動相，以0.6 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化條件對玉米秸稈預(yù)處理效果的影響

2.1.1 響應(yīng)面法優(yōu)化固定化條件

固定化小球?qū)τ衩捉斩掝A(yù)處理的效果通常受到溫度、pH值、交聯(lián)劑的質(zhì)量濃度、載體質(zhì)量濃度、交聯(lián)時間等條件的影響[7]，文中通過響應(yīng)面優(yōu)化法對固定化小球的制備條件(載體質(zhì)量濃度、交聯(lián)劑質(zhì)量濃度、交聯(lián)時間)等進(jìn)行3因素3水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，其中載體質(zhì)量濃度ρ1分別設(shè)置為20、30、40 g/L；交聯(lián)劑質(zhì)量濃度ρ2分別設(shè)置為50、75、100 g/L；交聯(lián)時間t分別設(shè)置為7、8、9 h，響應(yīng)面的響應(yīng)值為木質(zhì)素降解率η1。由表1可知，在ρ1為30 g/L、ρ2為75 g/L、t為8 h的條件下，制成的以SA為載體的煙曲霉菌CLL固定化小球?qū)τ衩捉斩挼念A(yù)處理效果最佳，預(yù)處理10 d后，對玉米秸稈中木質(zhì)素降解率為37.79%。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼值Table 1 Test factor levels and coded values

2.1.2 二次回歸模型的建立與顯著性分析

根據(jù)表2中的3×17CCD分析結(jié)果，同時利用Design Expert 進(jìn)行回歸分析，建立了木質(zhì)素降解率回歸方程為

表2 木質(zhì)素降解率的回歸模型方差分析及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 2 Regression model analysis of variance and coefficient significance test for lignin degradation ratio

η1=-415.425 62+5.594 16ρ1+0.070 693 0ρ2+

84.799 3+0.004 264ρ1ρ2-0.023 725ρ1t+

5.375 37t2。

該模型F值為685.04，P<0.001，表明模型擬合較好。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2為 0.992 8，說明這個模型能解釋99.28%響應(yīng)值的變化。結(jié)果表明該方程可以從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度預(yù)測各影響因素對木質(zhì)素降解率的影響。

2.1.3 降解效果的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

每個響應(yīng)面分別代表一個變量保持恒定條件下剩余兩個變量之間的交互作用。從圖1可以看出，每個響應(yīng)面都出現(xiàn)了一個明顯的峰值，說明最佳的固定化條件在選取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)。隨著載體質(zhì)量濃度、交聯(lián)劑質(zhì)量濃度以及交聯(lián)時間分別由20 g/L、50 g/L、7 d增加到30 g/L、75 g/L、8 d，玉米秸稈中木質(zhì)素的降解不斷增加，但當(dāng)載體質(zhì)量濃度、交聯(lián)劑質(zhì)量濃度和交聯(lián)時間繼續(xù)增加至40 g/L、100 g/L、9 d時，玉米秸稈各組分降解率不再增加甚至顯著減少。這是由于海藻酸鈉濃度越高，固定化細(xì)胞的強(qiáng)度越大，但是，當(dāng)濃度過高，高于30 g/L時，固定化細(xì)胞無法生長；當(dāng)濃度過低時，固定化球會破裂。當(dāng)交聯(lián)劑濃度(CaCl2)較低，低于75g/L時，固定化球較軟，易破碎。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，由于鹽的高滲透壓，微生物細(xì)胞活性降低[8]。一般來說，海藻酸鹽凝膠需要足夠的時間來完成Ca2+與糖鏈骨架中活性位點(diǎn)之間的協(xié)調(diào)[9]，Moreno-Garrido研究發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)時間越長，凝膠的機(jī)械強(qiáng)度越強(qiáng)，生物質(zhì)固定化效率越高，然而，交聯(lián)時間過長可能會使凝膠的結(jié)構(gòu)變緊，當(dāng)交聯(lián)時間超過8 h時，便不再利于基質(zhì)的傳遞和生物活性的發(fā)揮[10]。

圖1 不同參數(shù)對玉米秸稈中木質(zhì)素降解率的影響響應(yīng)面立體分析Fig. 1 Response surface three-dimensional analysis of effect of different parameters on degradation ratio of lignin in corn stalks

2.2 玉米秸稈的預(yù)處理效果

通過響應(yīng)面優(yōu)化固定化條件最終確定，在載體質(zhì)量濃度30 g/L、交聯(lián)劑質(zhì)量濃度75 g/L、交聯(lián)時間8 h的條件下制作的固定化煙曲霉菌CLL小球?qū)τ衩捉斩挼念A(yù)處理效果最好，使用最佳固定化條件下制作的固定化小球在30 ℃條件下，在液態(tài)條件下(底物質(zhì)量濃度10 g/L)發(fā)酵玉米秸稈24 d，每2 d取樣一次。如圖2所示，在預(yù)處理第4 d時，玉米秸稈中木質(zhì)素的降解率明顯增加至25.6%，說明在預(yù)處理第4 d時，玉米秸稈開始被降解，此時纖維素和半纖維素初步暴露出來，因此降解率沒有顯著增加。隨著預(yù)處理時間的不斷增加，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，隨即纖維素和半纖維素大面積暴露，在預(yù)處理中期時(6～16 d)，玉米秸稈中各組分的降解率不斷提高，在預(yù)處理第16 d時，木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率分別達(dá)到52.4%、29.23%和27.69%。在預(yù)處理第18～24 d時，玉米秸稈中各組分的降解率基本穩(wěn)定，最終在預(yù)處理24 d時，玉米秸稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別可達(dá)到55.9%、32.72%、31.76%。

圖2 固定化煙曲霉菌 CLL對玉米秸稈的降解效果Fig. 2 Effect of immobilized Aspergillus fumigatus CLL on degradation of corn stalks

2.3 玉米秸稈的結(jié)構(gòu)特征

圖3 玉米秸稈的 SEM圖片F(xiàn)ig. 3 SEM images of corn stalks

圖4 玉米秸稈的FTIRFig. 4 FTIR of corn stalks

2.4 預(yù)處理后玉米秸稈的糖化率

玉米秸稈資源利用的最終手段是糖化玉米秸稈中的纖維素類物質(zhì)，預(yù)處理過程可以破壞包裹在纖維素類物質(zhì)表面的一層致密木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，從而釋放纖維素和半纖維，強(qiáng)化纖維素、半纖維素糖化效果。在糖化過程中，起到關(guān)鍵作用的是纖維素酶。纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、軟體動物、原生動物以及微生物都有合成或分泌纖維素酶的能力，其中微生物主要包括真菌、細(xì)菌、放線菌等，針對真菌的研究比較多，其中，真菌降解纖維素最好的代表是里氏木霉，里氏木霉是絲狀好氧真菌，具有高效的降解潛力，工業(yè)上已形成完整的以里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)鏈[14]。

文中分別使用商品纖維素酶和里氏木霉纖維素酶對經(jīng)固定化煙曲霉菌CLL預(yù)處理后的玉米秸稈進(jìn)行糖化，結(jié)果見圖5。

圖5 纖維素酶對玉米秸稈糖化效果的影響Fig. 5 Effect of cellulase on saccharification effect of corn stalks

在預(yù)處理第4 d時，糖化率達(dá)到峰值，其中，里氏木霉纖維素酶對玉米秸稈的糖化率可達(dá)69.8%，商品纖維素酶的糖化率可達(dá)68.6%，這是由于在預(yù)處理4 d時，木質(zhì)素初步被降解，纖維素和半纖維素暴露出來且未被降解損耗。隨著預(yù)處理時間的增加，纖維素和半纖維素逐漸被降解，導(dǎo)致糖化率不斷下降；在預(yù)處理16d時，里氏木霉纖維素酶和商品纖維素酶對玉米秸稈的糖化率已經(jīng)低至25.4%和24.1%，且在糖化過程中，里氏木霉纖維素酶對玉米秸稈的糖化效果略優(yōu)于商品纖維素酶的糖化效果。由于商品纖維素酶價格昂貴，因此這也為纖維素類生物質(zhì)資源化節(jié)約了一定成本。

3 結(jié) 論

(1)在海藻酸鈉質(zhì)量濃度為30 g/L、交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為75 g/L、交聯(lián)時間為8 h的條件下，制作的固定化煙曲霉菌CLL小球?qū)τ衩捉斩挼念A(yù)處理效果最佳。

(2)在預(yù)處理24 d時，玉米秸稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別為55.9%、32.72%、31.76%。使用里氏木霉纖維素酶糖化玉米秸稈，在預(yù)處理第4 d時，可得到69.8%的最大糖化率，此時玉米秸稈的的資源化利用效率最高。