張鈺祺，易徐航，楊恢檢，熊毓，陳雅靜，周璇

萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 萍鄉(xiāng) 337000

復(fù)方天麻首烏片為萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由制何首烏、天麻、澤瀉、山楂4 味中藥組成，具有養(yǎng)血息風(fēng)，滋補(bǔ)肝腎之功效，主治肝腎陰虛所致的頭痛、頭暈?zāi)垦！⒖诳嘌矢?、腰酸乏力、脫發(fā)、白發(fā)及有上述癥狀的早期高血壓，腦動(dòng)脈硬化，脂溢性脫發(fā)，血管神經(jīng)性頭痛等。何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根。何首烏屬于典型的“生熟異治”中藥品種，其炮制品種制何首烏具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎、烏須發(fā)、益精血、化濁降脂等功效，常用于須發(fā)早白、血虛萎黃、腰膝酸軟、眩暈耳鳴、高脂血癥等［1］。何首烏中化學(xué)成分主要為二苯乙烯苷類，其中主要的藥效成分為2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［2-5］。研究表明，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷有降低總膽固醇，降血脂作用［6-7］。何首烏的炮制方法歷史上記載有很多，比如蒸制、黑豆制以及傳統(tǒng)的“九蒸九曬”等方式［8-9］，不同的炮制方法對(duì)何首烏的化學(xué)成分和內(nèi)在品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不同的影響［10］。制何首烏作為復(fù)方天麻首烏片中重要的君藥成分，其品質(zhì)的優(yōu)劣將直接影響到制劑的臨床療效。因此，為更好地對(duì)復(fù)方天麻首烏片中制何首烏進(jìn)行內(nèi)在質(zhì)量控制，保障該制劑的臨床療效，研究以2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為考察指標(biāo)，采用HPLC 法建立了復(fù)方天麻首烏片中制何首烏的含量測(cè)定方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 試藥

對(duì)照品：2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)PF180629-08，Stanford Analytical Chemicals Inc.，純度99.48%）；甲醇、乙腈（色譜級(jí)，北京百靈威公司）；其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水，復(fù)方天麻首烏片均由萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院提供。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司，型號(hào)1200）；萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler 公司，型號(hào)ME-204）；十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)Satorius 公司，型號(hào)CP225D）。

2 方法及結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇稀釋成每1 mL 含0.4 mg 的儲(chǔ)備溶液。

2.1.2供試品溶液的制備取供試品20 片，除去外層包衣，研細(xì)，取適量（約相當(dāng)于本品6 片），精密稱定，置具塞錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，取出放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性樣品溶液的制備取天麻100 g 粉碎成細(xì)粉；澤瀉 100 g、山楂 300 g 加水煎煮兩次，分別為2 h，1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，使其相對(duì)密度為1.16～1.20（60 ℃），加入乙醇使含醇含量達(dá)到60%，靜置沉淀48 h，取上清液，回收乙醇，濾液濃縮，使其相對(duì)密度為1.13～1.18（60 ℃），加入天麻細(xì)粉及淀粉適量，混合均勻，制粒干燥，使成100 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果表明：陰性樣品的HPLC 圖譜中，未出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，見圖1。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC -C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以水-乙腈（81∶19）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，波長(zhǎng)320 nm，色譜柱溫度為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，結(jié)果顯示，對(duì)照品與其他組分的色譜峰分離度良好。對(duì)照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，加甲醇逐級(jí)稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其含對(duì)照品濃度分別為10.64，21.28，42.56，85.12，170.24，340.48 mg/L。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程：Y=16.402 21X-8.838 97，r=0.999 99。結(jié)果表明對(duì)照品進(jìn)樣濃度在10.64～340.48 mg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.2精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液（85.12 mg/L）5 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄對(duì)照品的峰面積，RSD 為0.12%，結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批次（批號(hào)：20210303）供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 精密吸取5 μL 進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積，RSD 為0.78%。表明在室溫下供試品溶液12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次（批號(hào)：20210303）樣品六份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量（μg/g）。結(jié)果RSD 為1.30%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)取已知含量（456.7 μg/g；批號(hào)：20210303）的復(fù)方天麻首烏片樣品，研細(xì)，取約相當(dāng)于本品3 片，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定加樣回收率（n=6），結(jié)果表明2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率為95.15%（RSD%=2.42），結(jié)果見表1。2.3.6 耐用性試驗(yàn) 取同一批次（批號(hào)：20210303）樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，分別選擇Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種品牌的色譜柱，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果無(wú)明顯差別。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

取不同批號(hào)復(fù)方天麻首烏片樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備項(xiàng)下制備供試液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣和分析，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方天麻首烏片樣品中2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量（n=3，μg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

采用DAD 檢測(cè)器對(duì)2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，其最大吸收波長(zhǎng)為320 nm，因此選擇320 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相選擇中［11］，通過(guò)對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明乙腈-水（19∶81）條件下分離效果最好，峰形最佳，故選擇乙腈-水（19∶81）為流動(dòng)相。

3.2 提取方法及時(shí)間的考察

提取條件采用超聲提取法分別考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇三種提取溶劑，結(jié)果表明甲醇提取效率最高［11］。在此基礎(chǔ)上，分別考察了水浴加熱回流和超聲兩種方式，結(jié)果顯示水浴加熱回流提取效率更高，故選用水浴加熱回流方式。同時(shí)對(duì)甲醇溶液用量10 mL、25 mL、50 mL 以及加熱回流時(shí)間30 min、1 h、1.5 h 進(jìn)行考察，最后確定采用甲醇25 mL 加熱回流提取1 h 為宜。

3.3 小結(jié)

本研究建立了復(fù)方天麻首烏片中2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，從5 批復(fù)方天麻首烏片樣品中制何首烏的含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量為366.7～856.7 μg/g，可用于復(fù)方天麻首烏片的質(zhì)量評(píng)價(jià)。