萬(wàn)春云，張俊明，雷旭華，朱良輝，李玉云

1.江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心，江西 南昌 330000；2.江西佑美制藥有限公司，江西 上饒 333200

山蠟梅Chimonanthun nitensOliv.為我國(guó)特有的蠟梅科蠟梅屬植物，收載于《中國(guó)藥典》（1977 年版），主要分布于江西、安徽等地。山蠟梅藥用部位為其干燥葉，其中含有豐富的揮發(fā)油、總黃酮、生物堿、香豆素等成分，可以泡茶飲用，民間常用于治療感冒咳嗽。藥理研究表明，山蠟梅葉具有清涼消暑、降脂降壓的作用［1］。同時(shí)有研究表明，山蠟梅葉提取物在鎮(zhèn)咳、祛痰、鎮(zhèn)痛以及預(yù)防心腦血管疾病方面均有一定的藥理作用，且能明顯改善由感冒等引起的一系列臨床癥狀［2］，山蠟梅葉揮發(fā)油和濃縮水提液對(duì)金黃色葡萄球菌和流感病毒有較強(qiáng)的抑制作用［3］，山蠟梅感冒茶能顯著降低由醋酸引起的腹腔毛細(xì)血管的通透性、抑制蛋清所致大鼠腳腫，有較強(qiáng)的炎癥抑制作用［4］。然而山蠟梅葉發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛活性的有效部位以及物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)參照2015 年版《中國(guó)藥典》四部中揮發(fā)油測(cè)定法（甲法），蒸餾提取揮發(fā)油［5］，藥渣水煎醇沉后采用大孔吸附樹(shù)脂分離純化制備總黃酮，分別對(duì)30%乙醇和70%乙醇兩個(gè)提取部位的抗炎、鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行考察，以期初步篩選山蠟梅葉抗炎鎮(zhèn)痛的有效部位，為明確其物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

山蠟梅葉藥材由江西佑美制藥有限公司提供，由朱良輝研究員鑒定為蠟梅科蠟梅屬山蠟梅Chimonanthun nitensOliv.的干燥葉。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)ICR 小鼠120 只，體質(zhì)量范圍18～22 g，動(dòng)物合格證NO.43004700042165、NO.43004700049075，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，來(lái)源：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 儀器

鉆石牌秒表（上海秒表廠）；德國(guó)sartorius ME超微量電子天平；德國(guó)sartorius BS224S 電子天平；打孔器（孔徑8 mm，光大試驗(yàn)儀器廠）；UV2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津有限公司）。

1.4 試藥與試劑

阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)BJ38164，規(guī)格：100 mg）；布洛芬緩釋片（惠州大亞制藥股份有限公司，批號(hào)171104，規(guī)格：0.3 g）；二甲苯（上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號(hào)1408242）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)0080-9705）。其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

取山蠟梅葉2 kg，置提取罐中，加14 倍量水，提取揮發(fā)油5 h 后收集揮發(fā)油，另器保存。揮發(fā)油提取率為2.28%。

2.2 總黃酮的提取

2.2.1總黃酮含量測(cè)定方法以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，采用紫外分光光度法［NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色］在496 nm 處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，得回歸方程為：Y=10.298 83X+0.002 05，r=0.999 2，表明總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）在0.010 0～0.050 0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度A 呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.2總黃酮類成分的分離和富集取山蠟梅葉提取揮發(fā)油后的藥渣再加12 倍水煎煮提取1.5 h，濾過(guò)，濾液與揮發(fā)油提取后的水液合并，濃縮成清膏。放冷，加入等量乙醇，攪勻，靜置24 h，濾過(guò)，取水提醇沉浸膏，稀釋至藥材∶藥液=1∶1，加相同體積的乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯液無(wú)色，回收乙酸乙酯，殘?jiān)铀芙?，以藥材∶大孔?shù)脂1∶10 的比例上大孔樹(shù)脂柱，分別用水，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，95%乙醇洗脫，通過(guò)多次重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，將各洗脫液真空干燥，得干浸膏，分別取適量干浸膏，按上述山蠟梅葉中總黃酮的含量測(cè)定方法測(cè)定其中黃酮的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同洗脫部位中總黃酮的含量

經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)山蠟梅葉水提醇沉液中的黃酮類成分進(jìn)行富集，總黃酮含量較高的兩個(gè)部位均為30%乙醇和70%乙醇兩個(gè)部位，故我們將30%乙醇和70%乙醇合并，作為總黃酮提取部位。

2.3 山蠟梅葉中不同提取物對(duì)小鼠痛覺(jué)潛伏期的影響

取合格試驗(yàn)小鼠60 只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、總黃酮5 g/kg（低劑量組）及10 g/kg（高劑量組）、揮發(fā)油5 g/kg（低劑量組）及10 g/kg（高劑量組）和布洛芬緩釋片0.1 g/kg 劑量組，對(duì)照組給予動(dòng)物飲用水，給藥組按相應(yīng)組別給予不同的藥物，均20 mL/kg，1 次/d，連續(xù)給藥5 次，于末次給藥后1 h、2 h 將小鼠尾巴浸于水面以下3 cm，水溫（52.0±0.5）℃，小鼠受到熱刺激尾巴甩出水面，尾巴甩出水面的時(shí)間被記錄為疼痛的閾值，為了防止熱水對(duì)小鼠組織造成傷害，截止時(shí)間為10 s。

2.4 山蠟梅葉中不同提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

取合格試驗(yàn)小鼠60 只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、總黃酮低劑量組及高劑量組、揮發(fā)油低劑量組及高劑量組和阿司匹林腸溶片0.25 mg/kg 劑量組，對(duì)照組給予動(dòng)物飲用水，給藥組按相應(yīng)組別給予不同的藥物，均給予20 mL/kg，1 次/d，連續(xù)給藥5 次，末次給藥1 h 后，將小鼠右耳涂抹二甲苯溶液20 μL，均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，左耳不涂作對(duì)照，30 min 后處死，用打孔器于左右耳對(duì)稱部位打下耳片，用電子天平稱取各鼠耳質(zhì)量，并計(jì)算鼠耳腫脹率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.6 結(jié)果

2.6.1山蠟梅葉中不同提取物對(duì)小鼠痛覺(jué)潛伏期的影響試驗(yàn)在給藥后1 h、2 h，總黃酮高劑量組、揮發(fā)油低劑量組及高劑量組小鼠痛覺(jué)潛伏期明顯增加，與對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 山蠟梅葉不同提取物對(duì)小鼠痛覺(jué)潛伏期的影響試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2山蠟梅葉中不同提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹影響的試驗(yàn)結(jié)果除揮發(fā)油高劑量組外，其余各組對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹均有抑制作用，其中總黃酮高劑量組、揮發(fā)油低劑量組具有明顯的抑制作用，與對(duì)照組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 山蠟梅葉不同提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

山蠟梅葉中化學(xué)成分豐富，活性成分眾多，主要含有總黃酮、揮發(fā)油、生物堿類等成分［6-9］。國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站編著的《植物藥有效成分手冊(cè)》一書報(bào)道，以靜脈注射的方式將山蠟梅堿注射到狗和貓的體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)麻醉貓、狗的心臟有抑制作用，血壓下降約40%［10］；2018 年袁青青等研究發(fā)現(xiàn)山蠟梅葉揮發(fā)油具有良好的鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用［11］，本實(shí)驗(yàn)主要從鎮(zhèn)痛、抗炎兩方面開(kāi)展山蠟梅葉藥效學(xué)研究，以研究其抗炎鎮(zhèn)痛作用的有效部位。山蠟梅葉尚未收錄至現(xiàn)行藥典，僅收錄于地方標(biāo)準(zhǔn)，《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2014 年）》質(zhì)量控制僅局限于性狀、鑒別、浸出物等［12］，作者前期對(duì)總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，參考2015 年版《中國(guó)藥典》一部“槐米”項(xiàng)下總黃酮含量方法［13］和文獻(xiàn)方法［14］，即吸取供試品1 mL，置10 mL 量瓶中，加入甲醇4 mL，再加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，放置6 min 后，再加入10%硝酸鋁0.3 mL，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉4 mL，加水定容至刻度，搖勻，放置15 min 后，即得。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用氯化鋁顯色法顯色后吸光度衰減時(shí)間很短，而硝酸鋁顯色法則相對(duì)穩(wěn)定性較好，故選擇采用硝酸鋁顯色法?？寡祖?zhèn)痛實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可以看出，山蠟梅葉總黃酮高劑量組、揮發(fā)油組高劑量組在末次給藥后1 h、2 h 小鼠痛覺(jué)潛伏期明顯增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。山蠟梅葉揮發(fā)油和總黃酮對(duì)二甲苯致小鼠耳郭腫脹均有一定作用，其中總黃酮高劑量組、揮發(fā)油低劑量組具有明顯的抑制作用，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要特別指出的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量揮發(fā)油影響炎癥反應(yīng)并發(fā)揮抗炎作用，但高劑量揮發(fā)油具有刺激性作用，其機(jī)制可能與前列腺素、促炎細(xì)胞因子、一氧化氮以及組胺的參與有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明這一過(guò)程。綜上所述，揮發(fā)油總黃酮類化合物是山蠟梅葉抗炎鎮(zhèn)痛作用的主要藥效部位。此結(jié)論為山蠟梅葉抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用的研究提供了一定的依據(jù)，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。