張國(guó)禮，馬高民，柏文芳

（1.南京衛(wèi)崗奶業(yè)集團(tuán)奶源公司，南京 210095；2.南京市江寧區(qū)湯山街道動(dòng)物疫病防治站，南京 211131）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)常見(jiàn)的疾病，其發(fā)病率高，約為40%～70%，且危害嚴(yán)重。奶牛乳房炎的高發(fā)、頻發(fā)給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失，制約著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，我國(guó)每年由奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失約在150億～450億人民幣之間[1]。導(dǎo)致奶牛乳房炎發(fā)生的因素很多，病原微生物感染是其主要病因，其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌是引起乳房炎發(fā)生的主要致病菌。目前，奶牛乳房炎的治療仍然以抗生素治療為首選方法，但隨著乳房炎細(xì)菌耐藥性的不斷增強(qiáng)，乳房炎的治療變得更加困難。中藥是純天然藥物，含有多種生物有效成分，具有低毒、無(wú)殘留或低殘留、抗菌、消炎和不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，因此，國(guó)內(nèi)外專家逐漸關(guān)注應(yīng)用中藥來(lái)治療奶牛乳房炎[2]。銀杏又稱白果，屬我國(guó)的特產(chǎn)資源。有研究表明，銀杏葉及其提取物含有黃酮類、內(nèi)酯類、酚類、萜類、多糖等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、提高免疫力、抗炎、抗病毒等多種生物活性[3]，在防治奶牛乳房炎上具有廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)選取三個(gè)奶牛場(chǎng)并對(duì)乳房炎奶牛患乳區(qū)的乳樣進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，分離出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌，同時(shí)采集當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)的銀杏葉，采用中藥常規(guī)的煎煮法提取其有效成分，對(duì)耐抗生素的病原菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，從而為防治奶牛乳房炎和開(kāi)發(fā)利用銀杏葉提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

采集江蘇省不同地區(qū)的3個(gè)奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎和隱性乳房炎奶?；既閰^(qū)的乳樣。

銀杏葉來(lái)源于南京市幕府山，從5-11月份，每月15號(hào)采摘，共采7次。洗凈、晾干、干燥、粉碎，然后密封儲(chǔ)存于廣口瓶中備用。

1.2 培養(yǎng)基、試劑與儀器

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、麥康凱培養(yǎng)基（MA）、甘露醇培養(yǎng)基（MSA）、伊紅美蘭培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（均為杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為20200105、20200711、20201223、20200928、20200312），5%血瓊脂培養(yǎng)基（100mL普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入5mL兔血）。腸桿菌科生化鑒定管、葡萄球菌屬生化鑒定管、鏈球菌生化鑒定管（杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為20200805、20200290、20200420）及實(shí)驗(yàn)室常用試劑。離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、電爐等實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳樣采集

采樣前先用溫水清洗乳頭，再分別用2%碘液和75%酒精進(jìn)行消毒，在每次清洗或消毒乳頭后均用消毒紙巾擦干。棄去采樣乳區(qū)的頭3把奶，然后采集約10mL乳樣于滅菌試管中，加蓋封緊，并作好標(biāo)記，置于附有冰袋的采樣箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室備用。臨床型乳房炎判定標(biāo)準(zhǔn)：乳房有明顯的炎癥癥狀，乳區(qū)出現(xiàn)紅腫熱痛，擠奶時(shí)奶?？咕?，擠出的奶樣中有絮狀沉淀或顏色變化。隱性乳房炎判定標(biāo)準(zhǔn)：DHI檢測(cè)乳汁中體細(xì)胞數(shù)超過(guò)50萬(wàn)個(gè)/mL，患病奶牛無(wú)臨床癥狀。

1.3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定

采取乳樣5mL，接種于5%兔血清肉湯中，置37℃培養(yǎng)24h。再將培養(yǎng)物分別接種于甘露醇、麥康凱和血瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)24h。

在甘露醇培養(yǎng)基上挑取濕潤(rùn)、光滑、隆起的金黃色圓形菌落涂片，革蘭氏染色陽(yáng)性者，鏡檢，初步鑒定為金黃色葡萄球菌。同時(shí)將相同的菌落接種到5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中置37℃搖床中1 500r/min培養(yǎng)6～12h，再接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37℃培養(yǎng)18～24h后，接種于乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等微量生化鑒定管，進(jìn)行葡萄球菌屬生化鑒定。分離鑒定得到金黃色葡萄球菌。

在麥康凱培養(yǎng)基上挑取紅色菌落涂片，革蘭氏染色為陰性者，鏡檢，初步鑒定為大腸桿菌。同時(shí)將相同的菌落接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24h，再選取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上黑色帶金屬閃光的菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置37℃搖床中1 500r/min培養(yǎng)6～12h。再接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37℃培養(yǎng)18～24h后，接種于乳糖、葡萄糖、三糖鐵斜面、麥芽糖、靛基質(zhì)等微量生化鑒定管，進(jìn)行腸桿菌科生化鑒定。分離鑒定得到大腸桿菌。

在血瓊脂培養(yǎng)基上挑取溶血（α或者β）、灰白色、有乳光、表面光滑、邊緣整齊、直徑0.5～0.75mm的細(xì)小菌落涂片，革蘭氏染色為陽(yáng)性者，鏡檢，初步確定為鏈球菌。然后，將相同的菌落接種5%血清肉湯，置37℃搖床中1 500r/min培養(yǎng)6～12h，再接種于血瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18～24h，接種于蔗糖、葡萄糖、三糖鐵斜面、麥芽糖、靛基質(zhì)等微量生化鑒定管，進(jìn)行鏈球菌生化鑒定。分離鑒定得到鏈球菌。

1.3.3 血漿凝固酶試驗(yàn)

據(jù)葡萄球菌的鑒定結(jié)果，取若干支小試管，加1:4稀釋的新鮮兔血漿0.5mL，取一支加待檢菌肉湯培養(yǎng)物0.5mL作陽(yáng)性對(duì)照，取一支加生理鹽水作陰性對(duì)照；置37℃水浴鍋中水浴，每隔30min觀察一次結(jié)果，若3～4h內(nèi)試驗(yàn)管的陽(yáng)性對(duì)照管出現(xiàn)凝固，陰性對(duì)照管不凝固，判為陽(yáng)性。

1.3.4 觸酶試驗(yàn)

在載玻片上滴1滴3%的過(guò)氧化氫，調(diào)取純化的細(xì)菌放在過(guò)氧化氫中觀察變化，30s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性，鑒定鏈球菌。

1.3.5 試驗(yàn)菌液準(zhǔn)備

取菌液500μL，接種于5mLLB培養(yǎng)液中，37℃、1 500r/min連續(xù)搖蕩培養(yǎng)5～6h，細(xì)菌計(jì)數(shù)，使菌液濃度為107cfu/mL，4℃保存，以待備用。

1.3.6 銀杏葉有效成分提取

取干燥銀杏葉碎片30g，轉(zhuǎn)移至1 000mL圓底燒瓶中，然后加入300mL（×10倍量）蒸餾水浸泡2h，再加熱煮沸1h，然后用無(wú)菌干燥的6層紗布濾出液體，再加入180mL（×6倍量）蒸餾水，以60℃恒溫煎煮1h，6層無(wú)菌紗布再次過(guò)濾，將兩次濾液合并，60℃恒溫將藥液濃度濃縮至1g/mL，放入4℃保存，以待備用[4]。

在做抑菌試驗(yàn)前，取出上述水提液，向其內(nèi)加入無(wú)水乙醇，直至無(wú)水乙醇在混合液中的濃度為70%，封口，靜置，4℃過(guò)夜冷藏24h后取出，以3 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取其上清液，再向其內(nèi)加入無(wú)水乙醇，直至無(wú)水乙醇在混合液中的濃度為80%，封口，靜置，4℃過(guò)夜冷藏24h后取出，以3 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取其上清液，60℃恒溫使其多余的酒精蒸發(fā)掉，最后加蒸餾水定容至1g/mL，封瓶，流通滅菌30min，放入4℃保存，以待備用[5]。

1.3.7 銀杏葉提取物抑菌試驗(yàn)

向相應(yīng)培養(yǎng)基中注入50μL菌液（菌液濃度為107cfu/mL），涂勻，干燥3～5min后，采用平板打孔法，以直徑6mm為標(biāo)準(zhǔn)，在培養(yǎng)基上均勻打出3個(gè)孔并標(biāo)記，將培養(yǎng)皿底部微微對(duì)準(zhǔn)酒精燈火焰，加熱封底，然后吸取濃度為1g/mL的銀杏葉藥液50μL，分別做3次重復(fù)。放入4℃靜置2～4h（即待藥液全部吸收），然后置37℃培養(yǎng)24h。測(cè)量抑菌圈直徑d[5]。以抑菌圈直徑（d）＞20mm為極敏，15mm＜d≤20mm為高敏，10mm＜d≤15mm為中敏，d≤10mm為低敏[6]。

1.3.8 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定

取滅菌試管10支，編號(hào)，于1～9管中各加入無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基2mL，然后于第1管中加入1g/mL的藥液2mL，混勻后取出2mL加入第2管，依此類推，直到第8管中取出2mL棄去，第9管為肉湯對(duì)照，第10管為藥液對(duì)照。然后1～9管加入菌液0.1mL，搖勻，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。以不發(fā)生混濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥物的MIC值。將所有清晰無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的試管營(yíng)養(yǎng)液接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，以菌落數(shù)不超過(guò)5個(gè)的最低藥物濃度為該藥物的MBC值[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳房炎乳汁中的細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

從3個(gè)奶牛場(chǎng)中選取的奶牛乳房炎患乳區(qū)的乳樣中，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定、血漿凝固酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)共計(jì)篩選出43株金黃色葡萄球菌、35株大腸桿菌、26株鏈球菌。

2.2 銀杏葉提取物對(duì)病原菌的體外抑菌效果

分別選擇有代表性的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌各15株，編號(hào)1～15，做抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，不同月份銀杏葉提取物對(duì)不同的菌種抑菌效果不同，對(duì)相同的菌種不同的菌株抑菌效果不同；相同月份銀杏葉提取物對(duì)不同的菌種抑菌效果不同，對(duì)相同的菌種不同的菌株抑菌效果也不同。銀杏葉提取物對(duì)大腸桿菌的最大抑菌圈是20mm，其中秋季（9～11月）提取物對(duì)其15株菌均為高敏，其他月份抑菌圈均在低敏到高敏范圍內(nèi)；對(duì)金黃色葡萄球菌最大抑菌圈是22mm，9月份提取物對(duì)其有4株極敏，6株高敏，5株中敏，其他月份抑菌圈均在低敏到高敏范圍內(nèi)；對(duì)鏈球菌最大抑菌圈是24mm，9-10月份提取物對(duì)其有13株極敏，2株高敏，其他月份抑菌圈均在低敏到高敏范圍內(nèi)。結(jié)果表明，9月份銀杏葉提取物對(duì)三類菌的抑菌作用普遍比其他月份強(qiáng)。本試驗(yàn)中，銀杏葉提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌的極敏抑菌圈直徑分別為20mm、22mm、24mm，由此可知銀杏葉提取物對(duì)致病菌的抑菌作用為：鏈球菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

表1 不同月份銀杏葉對(duì)各種菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果 單位：d（mm）

2.3 銀杏葉提取物對(duì)病原菌的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

不同月份采集的銀杏葉，其提取物對(duì)乳房炎的3種主要致病菌均有不同程度的抑制作用。5-11月的銀杏葉提取物對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）范圍在31.25mg/mL～250mg/mL之間；對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）范圍均在31.25mg/mL～125mg/mL之間。7個(gè)月份采集的銀杏葉提取物，9月份的抑菌作用最強(qiáng)，其次為10月、11月份。結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，銀杏葉采摘的最佳時(shí)間應(yīng)該是秋季，尤其是9月份。

表2 銀杏葉提取物對(duì)病原菌的最小抑菌濃度 單位：mg/mL

2.4 銀杏葉提取物對(duì)病原菌的最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定結(jié)果

不同月份采集的銀杏葉提取物對(duì)奶牛乳房炎的3種致病菌均有不同程度的殺滅作用。5月至11月的銀杏葉提取物對(duì)大腸桿菌的最小殺菌濃度（MBC）范圍在62.5mg/mL～500mg/mL之間；對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌的最小殺菌濃度（MBC）范圍均在62.5mg/mL～250mg/mL之間。且對(duì)致病菌的殺滅作用為：鏈球菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌，最小抑菌濃度均低于最小殺菌濃度一個(gè)梯度，說(shuō)明銀杏葉提取物的抑菌效果比較穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 銀杏葉提取物對(duì)病原菌的最小殺菌濃度 單位：mg/mL

3 小結(jié)與討論

3.1 本試驗(yàn)從乳房炎奶牛的患乳區(qū)乳汁中分離得到大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌。應(yīng)用銀杏葉提取物做病原菌抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，銀杏葉提取物對(duì)鏈球菌抑菌作用最強(qiáng)，其次是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。最大抑菌圈分別是24mm、22mm和20mm，9-10月份銀杏葉提取物對(duì)鏈球菌有13株極敏，2株高敏；9月份銀杏提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有4株極敏，6株高敏，5株中敏；9-11月份銀杏葉提取物對(duì)大腸桿菌15株均為高敏；最小抑菌濃度均為31.25mg/mL，最小殺菌濃度均為62.5mg/mL。由此得出結(jié)論：秋季的銀杏葉提取物對(duì)奶牛乳房炎致病菌的抑菌效果最好，尤其是9月份的銀杏葉提取物。

3.2 據(jù)報(bào)道[8]銀杏葉中含有黃酮苷、萜內(nèi)酯、多糖、聚戊烯醇衍生物等多種生物活性成分并隨季節(jié)變化。本次試驗(yàn)在研究銀杏葉提取物對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌抑菌效果的基礎(chǔ)上比較了不同月份其提取物抑菌效果的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同月份采集的銀杏葉提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌效果不同。本研究結(jié)果中銀杏葉提取物抑菌效果強(qiáng)于李焰[9]、何克新[10]、周彥[11]等試驗(yàn)的抑菌效果。這種差異可能是由海拔高低、太陽(yáng)光及紫外線輻射強(qiáng)度、大氣溫度、晝夜溫度、空氣濕度、土壤溫度、水分狀況及地區(qū)差異和銀杏葉生長(zhǎng)年限等協(xié)同作用引起[12～14]。

3.3 試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，前期用以提取銀杏葉有效成分的溫度對(duì)抑菌效果具有較為明顯的影響。開(kāi)始以65℃提取銀杏葉有效成分，結(jié)果無(wú)抑菌作用，后查找相關(guān)文獻(xiàn)，分別設(shè)75℃、85℃和95℃為提取溫度，經(jīng)過(guò)對(duì)比，結(jié)果表明在95℃條件下，銀杏葉提取物的抑菌效果最好。今后可對(duì)銀杏葉有效成分提取溫度做進(jìn)一步探討。

3.4 本次試驗(yàn)表明，銀杏葉對(duì)奶牛乳房炎致病菌在體外有不同程度的抑制和殺滅作用，但其體內(nèi)抑菌效果還有待進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行觀察研究，只有體內(nèi)和體外抑菌效果一致且穩(wěn)定，才能確定銀杏葉對(duì)奶牛乳房炎致病菌具有抑制和殺滅作用。本試驗(yàn)初步表明，銀杏葉在防治奶牛乳房炎上具有可以期待的應(yīng)用前景，以其為原料可以開(kāi)發(fā)出價(jià)格便宜、作用廣泛的奶牛用中草藥制劑來(lái)取代長(zhǎng)期廣泛使用的化學(xué)藥物和抗生素，以使中草藥在奶牛乳房炎防治方面發(fā)揮更大的作用，逐漸實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖并生產(chǎn)無(wú)抗生素的優(yōu)質(zhì)奶。