呂濤，孫志文，劉龍飛

（1.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107；2.北京博歐實(shí)德生物技術(shù)有限公司，北京 100102）

牛奶被譽(yù)為“白色血液”，可以為人體提供大量營養(yǎng)物質(zhì)，但其中存在很多致病菌，合適的巴氏殺菌工藝能夠在有效殺滅致病菌的同時(shí)，最大程度地保持營養(yǎng)物質(zhì)的活性。但如果過度加熱，會(huì)使某些營養(yǎng)物質(zhì)失去活性，因此，為了既確保牛奶安全，又保護(hù)牛奶中營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞，需要對牛奶熱加工工藝進(jìn)行控制。

乳過氧化物酶是牛奶中天然存在的酶，也是牛奶中熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的酶。研究表明，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，乳過氧化物酶的活性逐漸降低，當(dāng)78℃加熱15s或74℃加熱60s時(shí)會(huì)完全失活[1]。而在巴氏殺菌（72℃、15s）條件下，乳過氧化物酶只會(huì)損失20%～30%的活性，并不會(huì)完全失活[2]。因此，乳過氧化物酶的活性是判斷巴氏殺菌過程中是否存在過度熱加工、熱處理等現(xiàn)象的一個(gè)非常重要的指標(biāo)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳過氧化物酶的檢測方法主要包括傳統(tǒng)比色法、ABTS法和TMB法，這些檢測方法主要基于顏色反應(yīng)、利用酶促反應(yīng)的原理進(jìn)行檢測，在乳過氧化物酶存在的情況下，基底物質(zhì)產(chǎn)生顏色，從而借助分光光度計(jì)或紫外光度計(jì)等通過測定發(fā)光度而計(jì)算出酶活力[3]。傳統(tǒng)比色法檢測成本較低，方法簡單，但是影響檢測結(jié)果的干擾因素較多，致使方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性較差，同時(shí)，所使用的底物也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)操作人員的身體健康。所以傳統(tǒng)比色法已經(jīng)被更加靈敏、安全的ABTS法和TMB法所取代[2]。ABTS法是目前國內(nèi)外研究較多的一種方法，該方法采用2,2'-偶氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）作為底物[4]，操作簡單，精確度與靈敏度相較傳統(tǒng)比色法具有很大的優(yōu)勢。但是其產(chǎn)生的有色產(chǎn)物穩(wěn)定性差，并且420nm不是酶標(biāo)儀的常規(guī)濾光片波長。因此該方法只能使用分光光度計(jì)讀數(shù)，對人員操作過程中的時(shí)間把控要求比較高，無法采用酶標(biāo)儀進(jìn)行大量樣品的檢測，通用性較差。TMB法相較于ABTS法，則使用了3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）作為底物。此方法的原理是：乳過氧化物酶催化TMB而被氧化，形成藍(lán)色物質(zhì)，加入酸性終止液如硫酸后，則會(huì)有黃色物質(zhì)產(chǎn)生，在450nm處有最大吸收峰[5]，經(jīng)過終止液處理后的黃色物質(zhì)更加穩(wěn)定。TMB方法與ABTS方法相比，靈敏度更高，反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性更強(qiáng)，因此結(jié)果重復(fù)性更好。另外，TMB法可同時(shí)檢測大量樣品，而ABTS法只能同時(shí)檢測少量樣品，不適用于大量樣品的檢測。因此本研究基于TMB法作為底物開發(fā)乳過氧化物酶的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀（裝載450nm濾光片），美國伯騰儀器有限公司；天平（感量為1mg），賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；離心機(jī)（≥3 000g），湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；渦旋振蕩器，德國IKA儀器公司；96孔微孔板，阿拉?。挥?jì)時(shí)器。

乳過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品（1600U/L）、檢測稀釋液、底物溶液和樣品處理溶液，均購自美國EvergreenSciences公司；硫酸（分析純），北京化學(xué)試劑研究所有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)過程

1.2.1 線性范圍的研究

將1 600U/L的標(biāo)準(zhǔn)品用檢測稀釋液連續(xù)2倍稀釋，獲得濃度為400、200、100、50、25U/L的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，以檢測稀釋液作為零標(biāo)準(zhǔn)品。分別向微孔中加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后向每個(gè)微孔中加入50μL濃度為7.2mg/L底物溶液，室溫避光孵育30min，然后向每個(gè)微孔中加入100μL終止液（0.18M H2SO4），在450nm處測定吸光度值。以乳過氧化物酶的活性濃度為X軸，吸光度值為Y軸，以四參數(shù)法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線示例

由圖1可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9991，具有良好的相關(guān)性，因此，可選擇0～400U/L作為線性范圍。

1.2.2 底物濃度的確定

由于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0～400U/L，稀釋后樣品中乳過氧化物酶的活力應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。為了保證顯色底物的充足及顯色反應(yīng)充分，顯色底物應(yīng)該過量，將乳過氧化物酶的活力設(shè)定為800U/L，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為30min。將50μL 800U/L的乳過氧化物酶加入微孔中，向每個(gè)微孔中加入50μL不同濃度的底物溶液，室溫避光孵育30min，然后加入100μL終止液（0.18M H2SO4），450nm下讀取每個(gè)微孔的吸光度值。檢測結(jié)果見圖2。

圖2 底物濃度與吸光度的關(guān)系

由圖2可見，隨著底物濃度的增加，吸光度值逐漸增加，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.2mg/L時(shí)，吸光度值趨于平穩(wěn)，因此選擇7.2mg/L作為底物的最佳濃度。

1.2.3 反應(yīng)條件的研究

1.2.3.1 孵育溫度的確定

將50μL不同活性的標(biāo)準(zhǔn)品和50μL已確定濃度的底物溶液（7.2mg/L），分別在14、17、20、23、26、30、32、34和36℃的溫度下孵育30min，然后加入100μL終止液（0.18M H2SO4），在450nm下讀取吸光度值。根據(jù)獲得的吸光度值和乳過氧化物酶的活性做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 孵育溫度的影響

由圖3可見，當(dāng)溫度低于20℃時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.9752和0.9786，當(dāng)溫度為32、34和36℃時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.9712～0.9858，因此，無論溫度低于20℃，還是溫度高于30℃，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均較低；而當(dāng)溫度為20～30℃時(shí)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，相關(guān)性較好。因此選擇20～30℃作為最佳實(shí)驗(yàn)溫度。

1.3.2.2 孵育時(shí)間的確定

向50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品中加入50μL已確定濃度的底物溶液（7.2mg/L），在室溫下分別孵育5、10、15、20和25min，然后加入100μL終止液（0.18M H2SO4），450nm下讀取吸光度值。檢測結(jié)果見圖4。

圖4 孵育時(shí)間與吸光度的關(guān)系

由圖4可見，當(dāng)孵育時(shí)間小于15min時(shí)，隨著孵育時(shí)間的延長，吸光度值逐漸升高，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到15min時(shí)，隨著孵育時(shí)間的延長，吸光度值趨于平穩(wěn)。因此，選擇15min作為加入底物后的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2.3 加終止液后有效讀取時(shí)間的確定

利用檢測稀釋液配制乳過氧化物酶活性濃度為0、25、50、100、200、400U/L的標(biāo)準(zhǔn)品，按照基本操作流程檢測，記錄加入終止液后不同時(shí)間的吸光度值，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品做2個(gè)平行，結(jié)果取平均值（見表1）。

表1 讀數(shù)時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

由表1可見，加入終止液30min內(nèi)，吸光度值變化不明顯，40min時(shí)吸光度值發(fā)生明顯變化。因此，加入終止液后應(yīng)在30min內(nèi)讀取吸光度值。

1.2.4 樣品前處理方法

選擇OD值接近零標(biāo)準(zhǔn)品的巴氏殺菌乳（熱處理?xiàng)l件為85℃，15s）樣品進(jìn)行乳過氧化物酶加標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為75、150和300U/L。取10mL加標(biāo)樣品，加入不同體積的樣品處理液，渦旋混勻，靜置5～10min，3 000g離心10min，用濾紙過濾，收集濾液進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，檢測結(jié)果取平均值，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 樣品處理液添加量數(shù)據(jù)表

由表2可見，當(dāng)10mL樣品中樣品處理液的添加量為0.6mL時(shí)，回收率為101.45%～103.99%，均接近100%；當(dāng)樣品處理液的添加量繼續(xù)增加時(shí)，回收率逐漸降低。因此，選擇0.6mL樣品處理液作為10mL樣品的最佳添加量。

1.3 檢測步驟

1.3.1 樣品處理

根據(jù)樣品中乳過氧化物酶的活性用檢測稀釋液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

吸取10.00mL樣品，置于15mL離心管中，加入0.6mL樣品處理液，渦旋混勻，靜置5～10min，3 000g離心10min，用濾紙過濾，收集濾液待測。

1.3.2 樣品檢測

南粵古驛道分布廣泛，沿途自然條件和歷史人文底蘊(yùn)各不相同，南粵古驛道標(biāo)識系統(tǒng)的建設(shè)效果對打造連續(xù)完整、具有整體效果的南粵古驛道歷史游徑具有重要意義。目前，南粵古驛道標(biāo)識系統(tǒng)以《南粵古驛道標(biāo)識系統(tǒng)設(shè)計(jì)指引》為基礎(chǔ)，在乳源西京古道、南雄梅關(guān)古道等地進(jìn)行了諸多嘗試，標(biāo)識主要類型集中于指引類和記名類，對于標(biāo)識的特色化實(shí)踐仍有待加強(qiáng)。美國歷史游徑標(biāo)識系統(tǒng)從多個(gè)方面為南粵古驛道標(biāo)識系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和表現(xiàn)方式提供了參考和借鑒，南粵古驛道標(biāo)識系統(tǒng)在吸取其經(jīng)驗(yàn)的同時(shí)，更應(yīng)當(dāng)在功能和表現(xiàn)上融入古驛道深厚的歷史文化內(nèi)涵和獨(dú)特的地域風(fēng)情，形成富有特色的南粵古驛道標(biāo)識系統(tǒng)，并以此為媒介，提升地方的知名度和鄉(xiāng)村的活力。

取出所需數(shù)量的微孔，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品位置，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品對應(yīng)一個(gè)微孔。向微孔中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，每加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品要更換一個(gè)新的吸頭。向每個(gè)微孔中加入50μL底物，吹打混勻，室溫避光孵育15min。向每個(gè)微孔中加入100μL終止液，吹打混勻。在加入終止液（0.18M H2SO4）30min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm下讀取并記錄每個(gè)微孔的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測限研究

選擇吸光度值接近零標(biāo)準(zhǔn)品的20份巴氏殺菌乳（熱處理?xiàng)l件為85℃、15s）作為陰性樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），檢測限LOD=平均值+3標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果見表3。

表3 陰性樣品檢測結(jié)果

由表3可見，20份陰性巴氏殺菌乳樣品中乳過氧化物酶活性的平均值為5.95U/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.36，檢測限為25.0U/L。

2.2 準(zhǔn)確度研究

選擇OD值接近零標(biāo)準(zhǔn)品的巴氏殺菌乳（熱處理?xiàng)l件為85℃、15s）樣品進(jìn)行乳過氧化物酶加標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為75、150和300U/L，每個(gè)樣品做6個(gè)平行，結(jié)果取平均值。準(zhǔn)確度=（檢測結(jié)果/加標(biāo)濃度）×100%。檢測結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收檢測結(jié)果

由表4可見，不同加標(biāo)濃度的回收率為101.93%～106.78%，變異系數(shù)為2.16%～3.17%。

2.3 特異性研究

過氧化物酶主要為乳過氧化物酶和過氧化氫酶，因此主要考核過氧化氫酶對乳過氧化物酶特異性的影響。

表5 乳過氧化物酶的特異性

由表5可見，采用本方法檢測過氧化氫酶的加標(biāo)樣品，不同過氧化氫酶加標(biāo)活性的檢測結(jié)果均遠(yuǎn)低于試劑盒檢測限25U/L，表明過氧化氫酶對乳過氧化物酶無交叉反應(yīng)，對檢測無影響。

2.4 精密度研究

2.4.1 批內(nèi)差異的研究

選擇OD值接近零標(biāo)準(zhǔn)品的巴氏殺菌乳（熱處理?xiàng)l件為85℃、15s）樣品進(jìn)行乳過氧化物酶加標(biāo)，使樣品中乳過氧化物酶的活性分別為50、200和350U/L，使用同一批次試劑盒檢測，每個(gè)樣品做5個(gè)平行，檢測結(jié)果見表6。由表6可見，變異系數(shù)為2.38%～4.29%，均低于10%。

表6 同一批次試劑盒的檢測結(jié)果

2.4.2 批間差異的研究

使用3批次試劑盒檢測生鮮乳和巴氏殺菌乳（熱處理?xiàng)l件為75℃、15s）各10個(gè)樣品，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值，檢測結(jié)果見表7。由表7可見，批次間的變異系數(shù)為2.28%～8.20%，均低于10%。

表7 不同批次試劑盒的檢測結(jié)果

2.4.3 實(shí)驗(yàn)人員間差異的研究

選擇生鮮乳和巴氏殺菌乳（熱處理?xiàng)l件為75℃、15s）各10個(gè)樣品，6個(gè)參與測試人員在相同實(shí)驗(yàn)室，按照同一方法檢測，每個(gè)樣品做2個(gè)平行，結(jié)果取平均值，檢測結(jié)果見表8。由表8可見，重復(fù)測定的變異系數(shù)在2.11%～8.70%，平均變異系數(shù)為4.59%。

表8 不同測試人員檢測結(jié)果

2.5 市售樣品檢測

選擇市售巴氏殺菌乳共20份，采用本方法進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做5個(gè)平行，檢測結(jié)果見表9。由表9可見，20份樣品的乳過氧化物酶活性為424.67～3 779.29U/L，其中4個(gè)樣品的乳過氧化物酶活性低于1 000U/L，16個(gè)樣品的乳過氧化物酶活性為1 000～4 000U/L。根據(jù)目前研究的結(jié)論巴氏殺菌熱損傷程度正常的產(chǎn)品乳過氧化物酶的活性在1 000～5 000U/L，市售巴氏殺菌乳的檢測結(jié)果表明80%的產(chǎn)品符合質(zhì)量要求。通過檢測表明，本方法可作為巴氏殺菌乳加熱程度的判斷依據(jù)。

表9 市售樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)果與討論

本研究采用TMB法檢測液態(tài)奶中的乳過氧化物酶，樣品中的乳過氧化物酶與底物3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）發(fā)生氧化反應(yīng)，形成藍(lán)色產(chǎn)物，加酸終止反應(yīng)后，變?yōu)辄S色，在450nm下測定吸光度，樣品中乳過氧化物酶的活性與吸光度成正比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0～400U/L時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.9991，相關(guān)性良好；20～30℃為酶與底物的最佳反應(yīng)溫度；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.2mg/L、添加量為50μL、反應(yīng)時(shí)間為15min時(shí)，可確保底物的量足夠用于反應(yīng)，且反應(yīng)充分；加入終止液后，30min內(nèi)讀取結(jié)果對結(jié)果無明顯影響。為了減少樣品基質(zhì)的干擾，需用樣品處理液對樣品進(jìn)行處理，當(dāng)10mL樣品中樣品處理液的添加量為0.6mL時(shí)，回收率為101.45%～103.99%，接近100%。采用該方法制備的試劑盒操作簡單快速，30min內(nèi)可完成樣品制備與檢測；靈敏度高，檢測限為25U/L；準(zhǔn)確率高，回收率為101.93%～106.78%；精密度高；特異性高，與過氧化氫酶無交叉反應(yīng)；可同時(shí)檢測大量樣品，滿足快速檢測的需要。根據(jù)市售巴氏殺菌乳樣品的檢測結(jié)果，約80%的樣品中乳過氧化物酶的活性＞1 000U/L，為巴氏殺菌乳加熱程度的判斷提供了一定依據(jù)。因此，本方法可作為優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳篩選的一種有效手段，是促進(jìn)我國優(yōu)質(zhì)乳工程有效實(shí)施、乳品行業(yè)健康發(fā)展的有利工具。