趙淑穎，姚大為，趙欣，丁向彬，馬毅

（1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；3.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

牛奶中乳脂含量是影響牛奶質(zhì)量的主要因素。不同的消費(fèi)者群體對牛奶脂肪的含量和比例有不同的要求。兒童的成長需要一杯高親脂蛋白和高脂肪的牛奶。相反，患有糖尿病、肥胖疾病的人更適合選擇低乳脂或脫脂牛奶產(chǎn)品。因此，在分子水平上探討乳脂代謝的規(guī)律因素，可以從根本上減少乳制品后期加工造成的營養(yǎng)損失和生產(chǎn)成本。改善牛奶中脂質(zhì)組成并選擇性地降低或提高乳脂含量是生產(chǎn)功能性牛奶的必然選擇。

miRNAs屬于內(nèi)源性非編碼RNA（ncRNAs），參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控并參與生物體的生命活動，已經(jīng)有多項試驗證明miRNAs參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及組織發(fā)育、免疫應(yīng)答與脂質(zhì)代謝[1～3]。miRNA可以通過其5'端2-8核苷酸與目標(biāo)基因mRNA的3' -UTR（3'非翻譯區(qū)域）的互補(bǔ)序列配對，以抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，從而對機(jī)體代謝進(jìn)行調(diào)控。

MiR-206為miRNAS中的一員，屬于miR-1家族，其他成員包括miR-133b、miR-133a-1、miR-133a-2、miR-1-1、miR-1-2[4]，其中miR-1-2和miR-133a-1、miR-1-1和miR-133a-2、miR-133b和miR-206分別組成作用相反的三個基因簇[5]。在乳脂代謝方面，姚大為等[6]通過奶牛乳腺上皮細(xì)胞的研究，表明miR-206抑制乳脂代謝相關(guān)基因（ACACA、FASN等）的表達(dá)，改變脂肪酸種類并下調(diào)甘油三酯的含量。

1 乳脂代謝

牛奶脂肪中含有大量人體需要的必需脂肪酸，乳脂中的中短鏈飽和脂肪酸可以起到防癌、抗病毒等功能[7]。反芻動物乳脂合成的前體主要來自瘤胃發(fā)酵作用的終產(chǎn)物乙酸、丁酸經(jīng)瘤胃壁糖異生作用氧化形成的β-羥丁酸，在乳腺上皮細(xì)胞中形成脂肪酸[8]。脂肪酸生成途徑除了從頭合成，還包括從血液循環(huán)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中攝取中長鏈脂肪酸[9]。乳脂代謝是一個復(fù)雜且協(xié)調(diào)的機(jī)制，需要多個基因的參與。與乳脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)對脂肪酸組成和甘油三酯的合成有很大的影響。包梅[10]研究表明SREBP1是人和動物的脂肪生成調(diào)控因子，通過調(diào)控參與乳脂代謝相關(guān)基因（FASN、SCD1）的表達(dá)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，進(jìn)而影響甘油三酯的合成。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）是核受體家族的成員，在多種組織和器官中表達(dá)，主要調(diào)控脂肪的合成與代謝[11]。乙酸經(jīng)脂肪酸合酶（FASN）轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。乙酰CoA羧化酶是一種生物素依賴性酶，催化乙酰CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A[12]，ACACA是其中的一個亞型，在脂肪生成組織中產(chǎn)生，用于從頭合成脂肪酸，被認(rèn)為是控制脂肪酸合成的主要亞型[13]。中短鏈飽和或不飽和脂肪酸經(jīng)超長鏈脂肪酸延伸酶（ELOVL6）催化生成長鏈飽和或不飽和脂肪酸，再經(jīng)硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）去飽和，在二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT1）和磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶6（AGPAT6）的作用下合成甘油三酯。甘油三酯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，與血漿載脂蛋白結(jié)合，以乳糜微粒的形式從乳腺上皮細(xì)胞分泌到腺泡腔形成乳脂[14,15]。脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP3）將長鏈脂肪酸運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，為SDC1提供底物。可以看出，牛乳腺脂質(zhì)合成需要幾個基因的協(xié)調(diào)表達(dá)來合成和分泌脂肪酸與甘油三酯。

2 miRNAs概述

miRNA為微小RNA，是一類內(nèi)源性非編碼RNA，其長度約為22個核苷酸（nt），并且具有較高的種間保守性[16]。研究表明，人類基因組可以轉(zhuǎn)錄不計其數(shù)的miRNA，并且超過60%的蛋白質(zhì)編碼基因受miRNA調(diào)控。此外，miRNA受表觀遺傳機(jī)制調(diào)控。miRNA的生物學(xué)功能研究在疾病控制和闡明生物過程中具有特定意義。

miRNAs在成熟以前要經(jīng)歷3種形式：miRNAs初始轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNAs）、前體miRNAs（premiRNAs）和miRNAs。miRNAs在內(nèi)含子與外顯子中都有分布。miRNAs基因在RNA聚合酶Ⅱ的催化下轉(zhuǎn)錄生成含有帽子結(jié)構(gòu)和poly尾巴的pri-miRNAs；核酸內(nèi)切酶Drosha和輔助因子作用于pri-miRNAs將帽子結(jié)構(gòu)和poly尾巴切去生成70個堿基左右的pre-miRNAs；premiRNAs由核內(nèi)轉(zhuǎn)移蛋白5轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，在核酸酶Dicer的作用下形成雙鏈miRNA，最后在胞內(nèi)降解成一條成熟的miRNA[17～19]。miRNAs參與細(xì)胞凋亡、增殖，有研究表明，miRNAs參與癌細(xì)胞的發(fā)生[20]并參與脂代謝等多種生物學(xué)過程[21]。

3 與牛乳脂代謝相關(guān)的miRNAs

目前關(guān)于乳脂代謝相關(guān)的miRNAs研究報道較少，主要集中在miR-33、miR-106、miR-27、miR-181a、miR-130a、miR-454、miR-29s、miR-34b等。有研究表明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-33a下調(diào)或上調(diào)超長鏈脂肪酸延伸酶6（ELOVL6）和羥烷基輔酶A脫氫酶B（HADHB）基因的表達(dá)，可促進(jìn)或抑制甘油三酯的合成。Chen等[22]的研究表明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-106b可顯著降低膽固醇和甘油三酯的含量，抑制miR-106b則相反。曹明月[23]在研究牛乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-27a顯著降低了甘油三酯的含量并抑制其靶基因PPARγ的mRNA的表達(dá)，從而抑制miR-27a顯著上調(diào)PPARγ的表達(dá)量；PPARγ是脂肪組織重要的標(biāo)志基因，其可通過激活脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)來增加細(xì)胞脂質(zhì)積累。有研究證實miR-181a、miR-130a在牛乳腺上皮細(xì)胞中分別調(diào)控酰基輔酶A合成酶1（ACSL1）、PPARγ而下調(diào)乳脂合成[24,25]。在乳腺上皮細(xì)胞中分別干擾miR-454和miR-29s上調(diào)或下調(diào)PPARγ的表達(dá)，還增加或減少甘油三酯的含量[26,27]。Wang等[28]研究表明miR-34b可減少奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量，過表達(dá)miR-34b可顯著抑制乳脂代謝相關(guān)基因PPARγ、FASN等的表達(dá)。

4 miR-206的研究進(jìn)展

miR-206的長度僅有21～25bp，牛的miR-206基因定位于23號染色體，成熟的miR-206序列在不同物種間具有高保守性[29]。miR-206在人腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與細(xì)胞增殖和遷移呈負(fù)相關(guān)[30,31]，miR-206促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞肌源性分化和增殖[32]。

雖然對于miR-206的研究較多集中在肌細(xì)胞的分化和凋亡[21]以及癌細(xì)胞的遷移上[33]，但是仍有研究證明miR-206會參與調(diào)控脂質(zhì)代謝。miR-206能夠降低Akt的磷酸化水平，PI3K/Akt信號通路是參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成的重要信號通路，miR-206在脂肪細(xì)胞中通過抑制PI3K/Akt信號通路下調(diào)脂質(zhì)代謝合成[34]。在肝細(xì)胞中，過表達(dá)miR-206會顯著降低肝X受體（LXRs）mRNA表達(dá)水平，肝X受體（LXRs）作為脂質(zhì)代謝過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其靶基因包括FASN、SREBP1和乙酰輔酶A（ACC）等與脂質(zhì)合成密切相關(guān)的基因，其表達(dá)量因過表達(dá)miR-206顯著降低，而導(dǎo)致細(xì)胞中脂滴的沉積減少。miR-206是脂質(zhì)生成的抑制因子，它能夠通過促進(jìn)胰島素信號通路降低肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)生成。miR-206抑制小鼠肝臟脂質(zhì)生成[34]；KLF4作為調(diào)節(jié)因子參與脂肪生成[12]。有研究表明，KLF4通過與C/EBPβ啟動子結(jié)合影響其表達(dá)進(jìn)而影響下游C/EBPα和PPARγ的表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪的生成[35]。徐珂[36]在豬的脂肪細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-206顯著降低脂肪細(xì)胞中的C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ的表達(dá)水平，導(dǎo)致脂肪生成量減少。在不同產(chǎn)奶豐度的牛乳腺上皮細(xì)胞中，miR-206的表達(dá)有顯著差異[37]。姚大為等[6]近期的研究表明，過表達(dá)miR-206顯著降低牛乳腺上皮細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因（ELOVL6、GPAM、LPIN1等）的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量降低，C14:0和C22:6n-3含量顯著降低，C16:1含量顯著增加；抑制miR-206表達(dá)后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量顯著升高，甘油三酯含量顯著上調(diào)，脂肪酸組成未發(fā)生明顯改變。GPAM影響細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量，是形成甘油三酯過程中的限速酶[38]。有研究顯示，敲除牛胚胎成纖維細(xì)胞中的GPAM可顯著降低甘油三酯的含量，并下調(diào)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平[39]。LPIN1可以編碼Mg2+依賴性的磷脂酶，促進(jìn)甘油三酯和磷脂合成；作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子調(diào)控PPARγ和PPARα等，進(jìn)而調(diào)控脂類代謝。LPIN1具有促進(jìn)甘油二酯和甘油三酯生物合成的作用[40]。MiR-206在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中對乳脂代謝起負(fù)調(diào)控作用，但是其下游關(guān)鍵靶基因和具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與展望

上述研究表明，目前關(guān)于miR-206參與脂肪酸調(diào)控機(jī)理的研究報道仍然較少，尤其是具有較高營養(yǎng)價值的短、中鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸代謝的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。近期的研究表明，miR-206對牛乳腺上皮細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，但是，miR-206對下游關(guān)鍵靶基因的調(diào)控機(jī)制以及靶基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞的功能還不清楚，有待進(jìn)一步研究。