◎ 黃卉卉，柳誠剛，王 清，王子偉，劉 濤，許雪霞

（信陽農(nóng)林學院 食品學院，河南 信陽 464000）

枸骨為冬青科冬青屬常綠植物，枸骨的果實、葉子和根部都具有一定的藥用價值，枸骨具有補肝腎、清熱涼血、祛風止痛等多種功效[1-4]。枸骨中含有多糖，多糖是一種重要的生命物質(zhì)，其參與了細胞的多種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，強化了機體自身的免疫功能，天然植物多糖提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗癌及延緩衰老等作用[5-7]。近年來，枸骨化學成分和功效的研究引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，但其多糖研究很少見報道。因此，為進一步開發(fā)利用枸骨資源，本研究以枸骨根為原料，運用響應面法優(yōu)化枸骨根多糖的提取工藝，以期為枸骨資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸骨根，購自信陽市醫(yī)藥公司，經(jīng)信陽農(nóng)林學院中藥教研室鑒定為枸骨根，干燥后粉碎備用。

苯酚（濟南創(chuàng)世化工有限公司）、濃硫酸（湖北鑫潤德化工有限公司）、葡萄糖（無錫市晶科化工有限公司）、無水乙醇、丙酮和乙醚，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外線分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；WK-4008高速藥物粉碎機：青州市（山東）精誠機械有限公司；LDZ4-0.8型離心機：北京醫(yī)用離心機廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京精科華瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 繪制標準曲線

準確稱取葡萄糖2.500 0 g，用蒸餾水溶解，定容于500 mL量瓶中。移取2 mL定容至100 mL容量瓶，即得濃度為100 μg·mL-1葡萄糖標準溶液。分別移取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL和0.9 mL于10 mL具塞試管中，加水至1 mL，搖勻，加入1 mL體積分數(shù)5%苯酚，搖勻后，加入5 mL濃H2SO4立即振蕩搖勻，放置15 min，在波長490 nm條件下測定吸光度，作濃度-吸光度曲線，得標準曲線方程Y=5.448 6X+0.004 7，R2=0.992 5[8]。

1.3.2 枸骨根多糖的提取流程

參照王清等[9]、王子偉等[10]提取工藝流程，確定枸骨根多糖的提取流程為：枸骨根粉末→熱水浸提→離心取上清液→減壓濃縮→加無水乙醇沉淀→丙酮、乙醚洗滌沉淀→真空干燥→枸骨根粗多糖。

1.3.3 枸骨根多糖的含量測定

采用苯酚-硫酸法[11]，即將所得到的粗多糖產(chǎn)品稀釋100倍，取多糖液2.0 mL緩慢加入5%的苯酚1.0 mL，搖勻，再加5.0 mL濃H2SO4，立即搖勻，室溫靜置15～20 min，于490 nm測其吸光值。利用標準曲線計算出多糖含量，得出多糖的提取率。實驗重復3次，取平均值。多糖提取率計算公式為：多糖提取率=（多糖含量/原料重）×100%。

1.3.4 單因素試驗

（1）提取時間對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉，分別溶于30 mL蒸餾水中，并于70 ℃溫度下分別水浴提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，過濾、離心得上清液，測定上清液吸光度。

（2）提取溫度對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉，分別溶于30 mL蒸餾水中，于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃溫度下水浴提取2 h，過濾、離心得上清液，測定上清液吸光度。

（3）液料比對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉，分別以液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1溶于蒸餾水中，于70 ℃溫度下水浴提取2 h，過濾、離心得上清液，測定上清液吸光度。

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以枸骨根多糖提取率為響應值，選取時間（A）、溫度（B）、液料比（C）這3個因素設(shè)計3因素3水平響應面優(yōu)化試驗，對枸骨根多糖提取工藝進行進一步優(yōu)化。響應面分析因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對枸骨根多糖提取率的影響

由圖1可看出，隨著提取時間的增加，枸骨根多糖提取率呈先增長后下降趨勢，當提取時間為2 h時提取率達到最大值，隨后提取率緩慢下降，說明多糖濃度已達到飽和，提取時間過長也可能導致其他物質(zhì)溶出，進而影響多糖的提取率。因此，提取時間應選擇2 h為宜。

2.1.2 提取溫度對枸骨根多糖提取率的影響

由圖2看出，隨提取溫度增高，枸骨根多糖提取率逐漸增高，至80 ℃達到最大值，隨后提取率下降，其可能的原因是溫度過高對枸骨根多糖的結(jié)構(gòu)有所影響，并造成多糖部分分解。因此，提取溫度應選擇80 ℃為宜。

2.1.3 液料比對枸骨根多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著溶劑用量增加，枸骨根多糖提取率呈先增大后降低趨勢，液料比為10∶1（mL·g-1）時提取率達最大值，是因為當液料比較小時，由于樣品中的多糖未能充分溶解，故多糖提取率隨著液料比的增大而升高；而達到10∶1后趨于穩(wěn)定，再增加溶液的體積對多糖提取率影響較小，考慮到成本效益，液料比應選擇10∶1為宜。

2.2 響應面法優(yōu)化枸骨根多糖提取工藝的試驗結(jié)果

2.2.1 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，可得到回歸方程：Y=5.22+0.049A-0.12B+0.32C-0.29AB+0.44AC+0.16BC-0.39A2-0.30B2-0.12C2。通過對方程的進一步分析可以確定優(yōu)化枸骨根多糖提取的最佳工藝參數(shù)組合。

表2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果表

2.2.2 方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對枸骨根多糖提取率結(jié)果進行方差分析，見表3。

由表3可看出模型P＜0.01，說明模型極顯著，且一次項C，交互項AB、AC，二次項A2、B2差異極顯著，一次項A、B，交互項BC，二次項C2差異不顯著，說明3個因素交互作用共同影響多糖提取率，不是單一因素作用的結(jié)果，且由P值大小可得各因素對多糖提取率影響為：C（液料比）＞B（溫度）＞A（時間）。

表3 方差分析表

2.2.3 響應面分析

對表2數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得二次回歸方程的響應曲面圖。由圖4、5、6可見，不同因素交互作用對枸骨根多糖提取率的影響程度不同，其中，提取時間（A）與提取溫度（B）、提取時間（A）與液料比（C）的交互作用均比較明顯，而提取溫度（B）與液料比（C）的交互作用不明顯，這與方差分析結(jié)果一致。

圖4表明了液料比取中心水平時，提取時間與提取溫度對枸骨根多糖提取率的交互作用。當液料比一定時，隨著提取時間和提取溫度的增加，枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降的趨勢。

圖5表明了提取時間取中心水平時，提取溫度與液料比對枸骨根多糖提取率的交互作用。當提取溫度一定時，隨著液料比的增加，枸骨根多糖提取率呈上升趨勢；當液料比一定時，隨著提取溫度的增加，枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降的趨勢。

圖6表明了提取溫度取中心水平時，提取時間與液料比對枸骨根多糖提取率的交互作用。由圖6可看出，當提取溫度一定時，隨著提取時間和液料比的增加，枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降趨勢。

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定

在提取時間、提取溫度、液料比單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件，經(jīng)過以上對模型方程的方差分析以及其響應面圖形分析可以得出枸骨根多糖提取的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果顯示，在液料比為12∶1 mL·g-1，提取時間為2.2 h，提取溫度為85 ℃時，理論上枸骨根多糖提取率達到最高，為5.62%。

2.2.5 驗證試驗

為檢驗結(jié)果的可靠性，依據(jù)最佳提取條件進行驗證試驗。設(shè)計3組平行試驗，測得枸骨根多糖提取率平均值為5.59%，與上述預測值5.62%誤差較小，表明該工藝穩(wěn)定可靠

3 結(jié)論

為更好地開發(fā)枸骨根資源，本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行了響應面優(yōu)化試驗，得到枸骨根多糖提取的最佳工藝條件為液料比12：1 mL·g-1，提取時間2.2 h，提取溫度85 ℃。此時理論上枸骨根多糖提取率可達到5.62%，驗證值為5.59%，說明其實際提取率與預測理論的最佳提取率相對誤差較小，故響應面法優(yōu)化枸骨根多糖提取的工藝參數(shù)可靠有效，可作為實際應用操作的參考，也為進一步研究枸骨根多糖奠定了理論基礎(chǔ)。