◎ 劉 梅，羅詩泳，李韻儀

（佛山市沃特測試技術(shù)服務(wù)有限公司，廣東 佛山 528000）

蜂蜜是一種營養(yǎng)豐富的天然食品，其中60%～80%是人體容易吸收的葡萄糖和果糖，具有抗氧化、抗菌、提高免疫力等生物活性，是一種食療佳品和天然藥品[1-2]。蜂蜜不僅能夠改善人體的血液循環(huán)、補充營養(yǎng)、緩解和恢復(fù)人體疲勞，還能起到潤肺止咳、消積通便等作用[3-4]。目前我國主要是傳統(tǒng)養(yǎng)蜂方式，在養(yǎng)殖過程中，蜂群極易感染美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病、麻痹病等疾病，蜂農(nóng)為了控制病害而出現(xiàn)濫用抗生素和農(nóng)藥的情況[5]。消費者食用蜂蜜后，很可能攝入蜂蜜中殘留的抗生素，影響健康。中國是世界蜂蜜生產(chǎn)、消費和出口大國，卻不是蜂蜜出口強國，主要原因在于蜂蜜質(zhì)量安全問題較為突出，蜂蜜質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)、檢測技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)相對滯后，屢屢遭遇國際貿(mào)易壁壘[6]。

因此，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確測定蜂蜜中多種藥物殘留的方法勢在必行。目前，蜂產(chǎn)品的獸藥殘留研究主要集中在蜂蜜、蜂王漿，檢測的方法主要有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，其靈敏度高、檢測時間短，可大大提高檢測效率[7-8]。本文建立了HLB固相萃取柱前處理，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer，HPLC-MS/MS）測定蜂產(chǎn)品中的喹諾酮類物質(zhì)的方法，方法快速、簡便、準(zhǔn)確，且適用于蜂蜜產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Xevo TQS），配有電噴霧離子源；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；固相萃取裝置（上海亞榮）。

氟甲喹（Flumequine，F(xiàn)LU）、噁喹酸（Oxolinic acid，OXO）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、伊諾沙星（Enoxacin，ENO）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、氟羅沙星（Fleroxacin，F(xiàn)LE）、司帕沙星（Sparfloxacin，SPA）、奧比沙星（Orbifloxacin，ORB）、雙氟沙星（Difloxacin，DIF）及達氟沙星（Danofloxacin，DAN）的混合液體標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為1 000 mg·L-1，購自壇墨質(zhì)檢公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純），均購自上海安譜公司。

15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 mg·L-1）的配制：準(zhǔn)確移取15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100 mg·L-1）1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇準(zhǔn)確定容至刻度。

15種喹諾酮類基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用乙腈-甲酸水（0.1%）（2+8，體積比）溶液稀釋，分別配制成濃度為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.00 mL，分別加于經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試料中，溶解殘余物（蜂王漿基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液需在4 ℃下2 000 r·min-1離心10 min），上清液過微孔尼龍濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

C18色 譜 柱（150 mm×2.0 mm，3 μm）； 流 動相：乙腈（A相）+0.1%甲酸水溶液（B相）；流速：0.4 mL·min-1；進樣體積：5 μL；柱溫：35 ℃；液相色譜梯度洗脫程序：0～1 min，A相保持5%；1～7 min，A相5%→90%；7～9 min，A相保持90%；9～12 min，A相90%→5%；12～13 min，A相保持5%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI源）；正離子模式（ESI+）檢測；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子源溫度：149 ℃；霧化溫度：595 ℃；毛細(xì)管電壓：0.56 kV。

1.2.3 樣品前處理

本方法分別采用了蜂蜜樣品和蜂王漿不同的測試基體進行了方法的運用。

蜂蜜：取試料2 g（準(zhǔn)確至0.02 g），于50 mL聚丙烯離心管中，加磷酸鹽緩沖液20 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，1 000 r·min-1離心5 min，取上清液，備用。

蜂王漿：取試料2 g（準(zhǔn)確至0.02 g），于50 mL聚丙烯離心管中，加磷酸鹽緩沖液10 mL，渦旋1 min，振蕩 10 min，4 ℃下 10 000 r·min-1離心 10 min，移取上清液至另一離心管。殘渣加磷酸鹽緩沖液10 mL重復(fù)提取，合并2次上清液，玻璃纖維濾紙過濾，備用。

HLB固相萃取柱分別用甲醇10 mL、水10 mL活化，備用液過柱，用水5 mL淋洗，抽干，依次用5%甲酸甲醇和乙酸乙酯各4 mL洗脫，抽干，收集洗脫液，40 ℃氮氣吹干，用20%乙腈甲酸水溶液1.00 mL溶解殘余物，超聲1 min，渦旋混勻（蜂王漿樣品溶液需在4 ℃下2 000 r·min-1離心10 min），上清液過微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。15種喹諾酮類藥物的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測下模式下15種藥物的質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 定量離子色譜情況

本文樣品前處理過程及色譜條件的優(yōu)化中，都使用了少量甲酸水溶液，加大了提取效率，利于形成色譜峰形，分離效果良好，且為目標(biāo)化合物提供質(zhì)子來源，提高了離子化效率。正離子模式下，目標(biāo)物經(jīng)過二級碰撞掃描，產(chǎn)生不同的碎片離子峰，以豐度最大的荷質(zhì)比（m/z）為各目標(biāo)化合物的定量離子，15種喹諾酮類物質(zhì)在100 μg·kg-1的定量離子色譜圖如圖1所示。

圖1 陰性樣品添加水平為100 μg·kg-1的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、檢出限及定量限的測定

分別向空白蜂蜜及蜂王漿基質(zhì)中加入測定濃度為 5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和 200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各 1.00 mL，上清液過微孔尼龍濾膜后，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以各藥物特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)曲的建立，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，各個組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線在5～200 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，滿足《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F的要求；同時根據(jù)《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》（GB/T 27417—2017）的要求，用信噪比法評估檢出限，以產(chǎn)生3倍信噪比信號的檢測濃度為最小檢出濃度，計算該檢測項目的方法檢出限。本方法參照標(biāo)準(zhǔn)GB 31657.2—2021 中檢測限為 0.5 μg·kg-1，配制濃度為1 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液上機測定，確定儀器的檢出限和定量下限。

表2 15種喹諾酮類物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表

2.3 方法的回收率及精密度

分別準(zhǔn)確稱取蜂蜜及蜂王漿樣品2 g（準(zhǔn)確至0.02 g），濃度加標(biāo)量均為1 μg·kg-1，按照1.2.3進行樣品前處理，按照1.2.1，1.2.2的色譜條件進行上機分析，每個相同的濃度加標(biāo)量分別測試6次，測試結(jié)果見表3，蜂蜜基質(zhì)的加標(biāo)組分的平均回收率在88.33%～111.67%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜20%，蜂王漿基質(zhì)的加標(biāo)組分的平均回收率在82.50%～116.67%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜20%，參照標(biāo)準(zhǔn)GB 31657.2—2021要求，添加水平1～5 μg·kg-1濃度下的回收率為60%～120%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，表明本方法測試結(jié)果回收率高，準(zhǔn)確度好，且測試結(jié)果的重現(xiàn)性好，精密度高。

表3 蜂蜜基質(zhì)和蜂王漿基質(zhì)中15種喹諾酮類物質(zhì)的加標(biāo)回收率、濃度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表

續(xù)表3

2.4 樣品測試情況

采用本文建立的方法對市場上的20款不同品牌的蜂蜜樣品進行分析，每款蜂蜜樣品各測試2次，測得其中2款蜂蜜樣品的譜圖見圖2。試驗結(jié)果顯示，所抽的蜂蜜測試樣品中，1款蜂蜜樣品中檢出恩諾沙星，濃度為1.2 μg·kg-1；1款蜂蜜樣品中檢出環(huán)丙沙星，濃度為10.4 μg·kg-1；其他的組分在本次所抽檢的蜂產(chǎn)品中均未檢出。

圖2 蜂蜜樣品的質(zhì)譜峰監(jiān)測圖

3 結(jié)論

本試驗采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了蜂產(chǎn)品中15種喹諾酮類化合物的檢測分析方法。結(jié)果表明，各個組分的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在5～200 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于 0.99，本方法測定檢出限為 0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1；蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)的平均回收率在82%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜20%。本方法回收率高，重現(xiàn)性好，靈敏度高，可用于蜂產(chǎn)品中喹諾酮類物質(zhì)的日常檢測。