◎ 苗紀(jì)芳，劉興國(guó)，張 麗，張雪珂，金 燕，宗珊盈

（1.中檢集團(tuán)中原農(nóng)食產(chǎn)品檢測(cè)（河南）有限公司，河南 鄭州 450008；2.賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，北京 100080）

維生素是人和動(dòng)物為維持正常生理功能而必須從食物中獲得的一種微量有機(jī)物質(zhì)，根據(jù)不同的物理性質(zhì)分為水溶性維生素和脂溶性維生素兩大類，其中脂溶性維生素A、D、E在人體的視覺能力、免疫功能、抗氧化和抗衰老能力等諸方面都有著重要的生理功能[1]。維生素缺乏會(huì)造成人體亞健康，因此對(duì)于維生素的補(bǔ)充越來越受到人們的重視。嬰幼兒及成人配方奶粉是脂溶性維生素強(qiáng)化的重要形式之一。

奶粉樣品基質(zhì)復(fù)雜，我國(guó)和歐洲關(guān)于食品中維生素D的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法中，需采用正相模式的制備液相色譜、反相色譜兩套儀器分別進(jìn)行凈化、制備和分析，分析效率很低[2-3]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化色譜條件，采用在線固相萃取的方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液液萃取、蒸干和復(fù)溶的步驟，并結(jié)合二維液相，在一維色譜柱上分析維生素E異構(gòu)體含量，維生素A、維生素D2和D3通過閥切換中心切割的方式轉(zhuǎn)移到二維色譜柱上進(jìn)行含量分析[4-5]。一次進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)了這幾種常見脂溶性維生素的分析，同時(shí)也可以避免樣品基質(zhì)對(duì)維生素A測(cè)定的干擾。

1 材料與方法

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

試劑：乙腈、甲醇、乙醇及異丙醇（色譜級(jí)，F(xiàn)isher公司）；去離子水（18.2 MΩ，Millipore純水機(jī)）；氫氧化鉀、抗壞血酸、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）和無水硫酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：維生素A（all-trans retinol，≥95%，Sigma-Aldrich）；維生素D2（98.1%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；維生素D3（99.6%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；α-生育酚（α-tocopherol，98.0%，Sigma-Aldrich）；γ、δ-生育酚（≥96%，Sigma-Aldrich）。

1.2 儀器與色譜柱

Thermo Fisher Vanquish高效液相色譜儀：含兩個(gè)Viper Only 2p-6p切換閥，檢測(cè)器Vanquish Diode Array Detector HL（含10 mm光纖池）和U3000 VWD3100 Detector（含11 μL流通池）；樣品收集環(huán)體積：500 μL；色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3；在線SPE柱：PLRP-S（12.5 mm×4.6 mm）；一維色譜柱：VITADE-005K2（150 mm×3.0 mm，3.0 μm）；二維色譜柱：VITADE-004K1（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

分別精密稱量維生素A，D2、D3，α、γ和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品適量，至10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度分別為0.062 3 mg·mL-1、0.097 0 mg·mL-1、0.097 0 mg·mL-1、1.144 0 mg·mL-1、2.651 0 mg·mL-1和 2.062 0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液制備：分別精密量取上述維生素A，D2、D3，α、γ和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，至10 mL棕色容量瓶中，50%乙醇稀釋定容成濃度在以下范圍內(nèi)的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（濃度范圍分 別 為 維 生 素 A 0.025～ 0.374 μg·mL-1，α- 維 生素 E 0.915～ 13.728 μg·mL-1、γ-維 生 素 E 2.121～21.211 μg·mL-1、δ- 維生素 E 1.649 ～ 24.740 μg·mL-1，維 生 素 D20.006 ～ 0.097 μg·mL-1、D30.006 ～0.097 μg·mL-1）。

1.3.2 供試品溶液制備

參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A、D、E的測(cè)定》（GB 5009.82—2016）[2]的方法，精密稱取固體奶粉試樣約5.00 g（精確到0.01 g）于150 mL平底燒瓶中，用約30 mL 45～50 ℃溫水使其溶解，混勻。加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻，再加入30 mL無水乙醇，充分混勻后，加入約20 mL 0.5 g·mL-1氫氧化鉀水溶液混勻，于80 ℃恒溫水浴振蕩、皂化約30 min。然后取出立刻用冷水冷卻至室溫，用50%乙醇水溶液轉(zhuǎn)移并定容到100 mL容量瓶中，混勻，高速離心約 5 min（＞ 5 000 r·min-1）后用 0.22 μm 針式過濾器過濾后上機(jī)分析。

1.3.3 色譜條件

流動(dòng)相：SPE pump 以乙醇∶水=4∶6為流動(dòng)相A，乙腈∶異丙醇=1∶1為流動(dòng)相B；1D pump 以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B；2D pump A以乙腈為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，水為流動(dòng)相C；流速：SPE pump，0～11.0 min為1.0 mL·min-1、11.5～20.0 min為0.3 mL·min-1、20.5～32.0 min 為 1.0 mL·min-1；1D pump，0 ～ 32.0 min 為 0.8 mL·min-1；2D pump，0 ～ 32.0 min為 1.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：100 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器條件：VWD采集波長(zhǎng)，0～10.0 min為325 nm，10.0～32.0 min為296 nm；DAD采 集 波 長(zhǎng)，0～32.0 min為264 nm。閥切換程序見表1，梯度洗脫條件見表2，儀器連接圖見圖1。

表1 閥切換程序表

表2 梯度洗脫條件表

圖1 儀器連接圖

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品溶液測(cè)定圖譜

精密稱取市售某品牌嬰幼兒配方奶粉5.001 g，按照供試品溶液制備方法進(jìn)行樣品制備，然后進(jìn)液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，維生素A、E、D測(cè)定色譜圖分別見圖2、圖3、圖4。

圖2 維生素A測(cè)定譜圖

圖3 維生素E測(cè)定譜圖（δ、γ和α-生育酚）

圖4 維生素D測(cè)定譜圖（該樣品中只含有維生素D3）

2.2 方法線性及定量限

按系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液配制方法配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)樣100 μL，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，考察方法的線性范圍及定量限。由表3可知，各化合物在其濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.999 0，方法靈敏度較高，維生素D3定量限滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 線性及定量限結(jié)果表

2.3 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

取市售某品牌配方奶粉樣品，等量加入標(biāo)識(shí)含量的維生素A、α-維生素E和維生素D3，按供試品溶液制備方法進(jìn)行樣品制備，測(cè)定各維生素含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，維生素A回收率為106.4%、α-維生素E回收率為102.1%、維生素D3回收率為98.7%，方法回收率較好。取以下濃度維生素A 0.125 μg·mL-1，α，γ，δ- 維生素 E 分別為 4.575 μg·mL-1、10.605 μg·mL-1、8.245 μg·mL-1，維生素 D20.030 μg·mL-1和維生素 D30.030 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，維生素A峰面積的RSD為1.89%，α，γ，δ-VE峰面積的RSD分別為2.53%，1.64%和2.19%，維生素D2和維生素D3峰面積的RSD分別為0.96%、0.82%，方法精密度較好。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

取市售某品牌配方奶粉樣品，分別按本方法與國(guó)標(biāo)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A、D、E的測(cè)定》（GB 5009.82—2016）方法進(jìn)行樣品制備和測(cè)定，各維生素含量結(jié)果見表4。由表4可知，本方法相對(duì)國(guó)標(biāo)方法的結(jié)果偏差小于5%。

表4 樣品中維生素含量測(cè)定結(jié)果表

3 結(jié)論

本方法基于賽默飛Vanquish液相色譜平臺(tái)搭建在線固相萃取-二維液相色譜，采用三泵兩個(gè)檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)了皂化液稀釋后上樣進(jìn)行維生素A、D、E異構(gòu)體的同時(shí)測(cè)定，采用高靈敏度光纖池可以滿足低含量維生素D的檢測(cè)，方法提高了奶粉樣品中脂溶性維生素的分析效率，可應(yīng)用于奶粉的日常檢測(cè)與評(píng)價(jià)。