黃炳泉，周云峰，吳喆，鄧杰華,黃招光，楊建冬

宜春市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 宜春 336000

龍膽瀉肝丸（水丸）來(lái)源于清代汪昂的《醫(yī)方集解》中的龍膽瀉肝湯，由10 種藥味組成，其中龍膽為君藥，梔子和黃芩為臣藥，其余為佐使［1］，現(xiàn)收載于2020 年版《中國(guó)藥典》［2］。龍膽瀉肝丸具有清肝膽、利濕熱的功效，主治濕熱帶下、尿赤澀痛、肝膽濕熱、耳鳴耳聾、耳腫疼痛、脅痛、頭暈?zāi)砍?、口苦等癥［2］，主要不良反應(yīng)有全身性紅斑、腎損害等［3-5］。

2003 年的龍膽瀉肝丸腎毒性事件使其藥品質(zhì)量一直受到廣泛關(guān)注［5-6］。2021 年宜春市食品藥品檢驗(yàn)所承擔(dān)了江西省藥品計(jì)劃抽驗(yàn)該品種的評(píng)價(jià)抽驗(yàn)工作。為了全面分析該市售制劑品種的質(zhì)量水平，采用法定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行探索性研究，從藥品安全性、有效性、真實(shí)性和均一性等方面進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和明確監(jiān)管方面提供依據(jù)和參考。

1 樣品基本信息

此次抽取水丸樣品共50 批次，涵蓋江西省11個(gè)地級(jí)市和藥都樟樹(shù)市，均抽于經(jīng)營(yíng)企業(yè)包括零售藥店和連鎖藥店，樣品有4 個(gè)規(guī)格（每袋裝6 g、每100 粒重6 g、60 g/瓶和每袋裝3 g）。據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站數(shù)據(jù)查詢(xún)，目前全國(guó)共有170 家生產(chǎn)企業(yè)獲得了龍膽瀉肝丸的生產(chǎn)許可，批準(zhǔn)文號(hào)有208 個(gè)，所抽水丸樣品共涉及17 家生產(chǎn)企業(yè)（占10.0%）和17 個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)（占8.2%），樣品其他信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)藥品使用說(shuō)明書(shū)可知，所有樣品的質(zhì)量執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2020 年版一部，該標(biāo)準(zhǔn)中包括的檢驗(yàn)項(xiàng)目有性狀、鑒別（顯微、龍膽苦苷、梔子苷、甘草），檢查（水分，重量差異、裝量差異、裝量、崩解時(shí)限），含量測(cè)定（龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷）和微生物限度（需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌、沙門(mén)菌、大腸埃希菌和耐膽鹽革蘭陰性菌）。按照法定標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，所有樣品均符合規(guī)定，合格率為100%。

2.1 性狀

樣品應(yīng)為暗黃色的水丸，味苦。在對(duì)樣品的外觀性狀進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)樣品的顏色與規(guī)定要求一致，但也有不少企業(yè)樣品的顏色偏棕黃色或棕

褐色。根據(jù)對(duì)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行電話調(diào)研或函調(diào)可知，藥材由于受產(chǎn)地來(lái)源、采摘季節(jié)、質(zhì)量等影響，會(huì)導(dǎo)致不同批次藥粉顏色也不盡相同，難以實(shí)現(xiàn)不同批次樣品暗黃色單一顏色的統(tǒng)一，建議藥丸顏色修訂為過(guò)渡色“棕黃色至棕褐色”。

2.2 鑒別

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)黃芩（韌皮纖維）、炙甘草（晶纖維）、梔子（石細(xì)胞）、澤瀉（內(nèi)皮層細(xì)胞）、鹽車(chē)前子（種皮內(nèi)表皮細(xì)胞）、地黃（薄壁組織）和柴胡（油管）進(jìn)行了顯微鑒別，該方法能較好地找出各藥味的特定植物細(xì)胞組織，專(zhuān)屬性較好，但由于各藥味的植物細(xì)胞組織數(shù)量較少，且會(huì)互相覆蓋干擾，影響判斷，可能需要消耗較長(zhǎng)時(shí)間才能鑒別出各藥味；鑒別項(xiàng)還包含了3 個(gè)薄層色譜鑒別，分別對(duì)樣品中龍膽苦苷（龍膽）、梔子苷（梔子）、甘草進(jìn)行了定位和顏色判定分析，結(jié)果表明，在相同的位置上，樣品均含有與龍膽苦苷、梔子苷和甘草顏色一致的斑點(diǎn)。需要注意的是，同一或不同企業(yè)的不同批次樣品的斑點(diǎn)顏色深淺不一，提示龍膽、梔子和炙甘草3 種藥味的質(zhì)量可能參差不齊。

2.3 檢查

重量差異可以反映批間和批內(nèi)藥物含量的一致性［7］，除另有規(guī)定（含量均勻度）外，水丸需要進(jìn)行重量差異檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)的制劑規(guī)格不同，每10 丸的重量會(huì)有較大差異，但與標(biāo)示丸重或平均丸重進(jìn)行比較，均未超出重量差異限度；對(duì)于單劑量包裝的丸劑需要進(jìn)行裝量差異檢查，對(duì)于以重量標(biāo)示的多劑量包裝丸劑需要進(jìn)行裝量檢查，按照要求，這類(lèi)水丸樣品均符合規(guī)定；該標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)水丸的溶出度作出規(guī)定，需要進(jìn)行崩解時(shí)限檢查，所有樣品均在60 min 內(nèi)崩解完全，符合限度要求，但不同企業(yè)間樣品崩解時(shí)限會(huì)有較大差異，這可能與各企業(yè)的生產(chǎn)工藝參數(shù)不同有關(guān)。

水分含量的多少對(duì)制劑的穩(wěn)定性、理化性狀及藥效作用等均有影響。中藥復(fù)方制劑在水分較高的環(huán)境下易發(fā)生霉變、微生物滋生、有效成分水解失活等情況，這會(huì)使藥品藥效降低，甚至發(fā)生健康安全事故，有必要對(duì)龍膽瀉肝丸（水丸）的水分含量進(jìn)行測(cè)定。烘干法操作簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境幾乎無(wú)污染，能較大程度除去水分，因此采用此法測(cè)定了50 批水丸水分含量。從結(jié)果可知，樣品的水分含量均未超出限度（9.0%），合格率為100%，說(shuō)明各企業(yè)能將產(chǎn)品水分控制在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。同時(shí)，在對(duì)各企業(yè)樣品的水分含量分布情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同企業(yè)對(duì)水分的控制還是具有一定的差異性，這可能與各企業(yè)的生產(chǎn)工藝有偏差有關(guān)，如物料的滅菌方式、制劑的干燥溫度等，另外儲(chǔ)藏環(huán)境如溫度和濕度也會(huì)對(duì)水分的含量有影響。

2.4 含量測(cè)定

HPLC 法的分辨率和靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好、定量精度高、應(yīng)用范圍廣，適用于分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物，已作為部頒標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定中藥有效成分含量的常用方法。該藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC 法測(cè)定了方中君藥（龍膽）和臣藥（梔子、黃芩）的含量，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定本品每l g 含龍膽以龍膽苦苷計(jì)不得少于0.80 mg、含梔子以梔子苷計(jì)不得少于l.30 mg、含黃芩以黃芩苷計(jì)不得少于3.80 mg。結(jié)果顯示樣品均含有龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷成分，龍膽苦苷含量為1.09～6.74 mg/g，梔子苷含量為2.02～4.25 mg/g，黃芩苷含量為4.07～11.62 mg/g，說(shuō)明這3 種藥味不存在不投料的風(fēng)險(xiǎn)，不同企業(yè)樣品中這3 種成分含量有不小差異，提示不同生產(chǎn)企業(yè)的水丸樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷含量參差不齊，推測(cè)不同企業(yè)龍膽、梔子和黃芩原料質(zhì)量存在差異。另外，對(duì)同一企業(yè)的不同批次樣品各成分含量進(jìn)行分析，除了個(gè)別少數(shù)企業(yè)各成分含量分布比較均勻外，大多數(shù)企業(yè)原料質(zhì)量可能不夠穩(wěn)定。各企業(yè)的龍膽、梔子和黃芩原料質(zhì)量均有差異，但均在可控范圍內(nèi)，說(shuō)明現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這3 種成分含量限度設(shè)定比較合理。

2.5 微生物限度

對(duì)中成藥中污染微生物的數(shù)量檢查是保證藥品安全性的重要手段之一。藥品在生產(chǎn)過(guò)程中難以避免會(huì)帶入一些微生物，如果滅菌不完全，對(duì)人體有毒害作用的微生物滋生可能會(huì)使藥品失效，甚至代謝產(chǎn)物如黃曲霉素會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生強(qiáng)烈的致癌作用，必須使污染微生物的殘留量控制在安全水平?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：需氧菌總數(shù)≤104cfu/g；霉菌和酵母菌總數(shù)≤102cfu/g；耐膽鹽革蘭陰性菌＜102cfu/g；沙門(mén)菌不得檢出；大腸埃希菌不得檢出。實(shí)驗(yàn)采用平皿菌落計(jì)數(shù)法對(duì)上述菌種進(jìn)行計(jì)數(shù)檢查，結(jié)果顯示各種微生物數(shù)量均在限度要求內(nèi)，這說(shuō)明各生產(chǎn)企業(yè)的滅菌工藝可行且穩(wěn)定。

3 探索性研究結(jié)果與分析

藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)雖然可以一定程度上反映藥品質(zhì)量，但由于中藥復(fù)方的復(fù)雜性，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)難以解決全部的中藥質(zhì)量問(wèn)題。所以，在評(píng)價(jià)抽驗(yàn)過(guò)程中，除法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)外，還需要做進(jìn)一步的探索性研究工作，對(duì)法定標(biāo)準(zhǔn)中未涉及到的與藥品安全性、有效性、真實(shí)性及質(zhì)量穩(wěn)定性相關(guān)的內(nèi)容進(jìn)行深入研究，以便對(duì)中藥產(chǎn)品質(zhì)量有更加深入而全面的評(píng)價(jià)。

3.1 重金屬檢查

樣品方中龍膽、黃芩、澤瀉、地黃、柴胡、木通、酒當(dāng)歸，及炙甘草均以根或根莖入藥，而這些藥味的根和莖易富集和吸收以銅、砷、汞、鉛、鎘為主的重金屬及有害元素，有可能會(huì)引入成藥中，帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)，造成人體器官組織損傷。探索性研究運(yùn)用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）對(duì)樣品中上述5 種重金屬及有害元素的殘留量進(jìn)行測(cè)定，并采用靶器官毒性劑量（TTD）［8-9］和二元證據(jù)權(quán)重分析法（WOE）［10］兩種模型對(duì)樣品進(jìn)行非致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。按照《中國(guó)藥典》四部對(duì)中藥中重金屬的限量指導(dǎo)值（鉛不得超過(guò)5 mg/kg，銅不得超過(guò)20 mg/kg，砷不得超過(guò)2 mg/kg，汞不得超過(guò)0.2 mg/kg，鎘不得超過(guò)1 mg/kg）［11］，50 批樣品有1 批砷超標(biāo)，8 批汞超標(biāo)，涉及5 家企業(yè)，總超標(biāo)率約為18.0%；采用TTD 和WOE 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型對(duì)樣品整體性進(jìn)行非致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，危害指數(shù)值HI均超過(guò)安全閾值（1.00），50 批次樣品整體上可能存在一定的非致癌風(fēng)險(xiǎn)。由此可見(jiàn)，樣品中5 種重金屬及有害元素的殘留量可能處在較高水平。建議企業(yè)應(yīng)重視重金屬及有害元素帶來(lái)的外源性污染問(wèn)題，把控原料質(zhì)量和生產(chǎn)各環(huán)節(jié)，從源頭上減少中藥制劑重金屬污染的風(fēng)險(xiǎn)，保障用藥安全。

3.2 澤瀉含量測(cè)定

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)澤瀉進(jìn)行了顯微定性鑒別，而未對(duì)其進(jìn)行定量分析。在反饋的調(diào)研結(jié)果中，有部分企業(yè)反映會(huì)不時(shí)購(gòu)到含量達(dá)不到要求的澤瀉原料，這有可能會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量較差的澤瀉進(jìn)入成藥的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而無(wú)法保證藥品的有效性。為了大致考察樣品中澤瀉藥味的質(zhì)量水平，探索性研究采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定澤瀉的特征性成分23-乙酰澤瀉醇B 的含量，并根據(jù)藥典中澤瀉的23-乙酰澤瀉醇B 下限值及在制劑中原粉入藥的轉(zhuǎn)移率（90%），擬定了23-乙酰澤瀉醇B 在水丸樣品中限度值。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，50 批樣品中有1 批的23-乙酰澤瀉醇B 含量低于理論限值，約是理論限值的三分之一，相差較大，提示該企業(yè)的澤瀉原料在質(zhì)量或投料生產(chǎn)方面可能存在較高風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 當(dāng)歸摻偽檢查

查閱文獻(xiàn)相關(guān)資料和日常檢驗(yàn)得知，當(dāng)歸的摻偽混淆品有獨(dú)活、歐當(dāng)歸、東當(dāng)歸和日本當(dāng)歸等，其中以獨(dú)活較為常見(jiàn)［12-14］。水丸樣品方中含有當(dāng)歸，為了考察藥品的真實(shí)性，課題組以當(dāng)歸藥味為探索點(diǎn)，篩查制劑中是否含有獨(dú)活成分。獨(dú)活的特征性成分為蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯，當(dāng)歸中不含有。探索性研究基于此采用UPLC-MS/MS 法建立了樣品中獨(dú)活成分的檢查方法。結(jié)果顯示，有少量樣品檢出了獨(dú)活的特征性成分蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯，考慮二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯易水解，選用穩(wěn)定性較高的蛇床子素作為轉(zhuǎn)移率指標(biāo)成分推算獨(dú)活的混有量，均小于3.0%，低于藥典規(guī)定雜質(zhì)的上限值，說(shuō)明當(dāng)歸在采集時(shí)可能是客觀因素帶入了少量性狀相似的獨(dú)活。

3.4 紅外光譜

中藥制劑質(zhì)量的均一性直接影響到臨床用藥安全性和有效性，也關(guān)系到患者的健康和安全，因此探索性研究有必要對(duì)龍膽瀉肝丸制劑的質(zhì)量均一性進(jìn)行檢查。中紅外光譜分析技術(shù)由于具有簡(jiǎn)便、環(huán)保、分析速度快、可定性和定量等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于藥品的質(zhì)量分析［15-16］。本研究采用中紅外光譜技術(shù)并結(jié)合偏最小二乘判別分析法對(duì)龍膽瀉肝丸的質(zhì)量均一性進(jìn)行考察，將50 批龍膽瀉肝丸樣品的平均紅外光譜圖的全波段譜圖進(jìn)行二階求導(dǎo)、多元散射校正和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量預(yù)處后，進(jìn)行了偏最小二乘判別分析。結(jié)果顯示，同一企業(yè)的不同批次的樣品可以聚為1 類(lèi)，說(shuō)明各企業(yè)的生產(chǎn)工藝均較穩(wěn)定，樣品質(zhì)量均一性較好，而不同企業(yè)的樣品除少數(shù)能聚為1 類(lèi)外，大多數(shù)不能聚為1 類(lèi)，離散程度較高，這主要可能與各企業(yè)所采購(gòu)的中藥材原料質(zhì)量有差異有關(guān)，建議需規(guī)范各原料的來(lái)源和采收季節(jié)，并嚴(yán)格控制生產(chǎn)工藝，這有助于促進(jìn)不同企業(yè)生產(chǎn)同一劑型制劑的質(zhì)量趨于均一性。中藥制劑成分復(fù)雜，其療效成分不單單是一種起作用，對(duì)單一成分進(jìn)行質(zhì)量控制無(wú)法反映質(zhì)量全貌。因此采用中紅外光譜技術(shù)對(duì)龍膽瀉肝丸進(jìn)行質(zhì)量均一性檢查，對(duì)中藥質(zhì)量控制以及促進(jìn)中藥健康發(fā)展具有重要意義。

4 討論

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，樣品合格率為100%；進(jìn)行探索性研究分析，樣品達(dá)標(biāo)率為88%。這說(shuō)明所有樣品的質(zhì)量能達(dá)到現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)要求，但探索性研究結(jié)果提示有部分企業(yè)的產(chǎn)品可能存在潛在的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，可考慮提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。企業(yè)在嚴(yán)格控制現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的組分時(shí)，也不能忽視標(biāo)準(zhǔn)外未控制的藥味組分和風(fēng)險(xiǎn)因素。這是因?yàn)橹兴幹苿┧幮У陌l(fā)揮往往是方中多種藥味的多種成分聯(lián)合作用的結(jié)果，一種或多種原料藥質(zhì)量的失守，會(huì)直接導(dǎo)致成藥質(zhì)量的下降，甚至造成藥品安全事故。

綜合法定標(biāo)準(zhǔn)與探索性研究結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，水丸整體表現(xiàn)較好。但探索性研究只做了部分工作，隨著研究的深入，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的潛在問(wèn)題。除了建議監(jiān)管部門(mén)加強(qiáng)對(duì)原料藥材和復(fù)方制劑的監(jiān)管外，更重要的是供應(yīng)商和生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)該加強(qiáng)自身質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)意識(shí)，誠(chéng)信為本，良心經(jīng)營(yíng)，減少藥品安全事故的發(fā)生，保障藥品安全有效、質(zhì)量可控。