馮玨利,王 瑛,常新捷,步星耀

1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科,洛陽 471000;2.河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州 450000

神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童期最常見的顱外實體惡性腫瘤,可發(fā)生于外周交感神經(jīng)系統(tǒng)的任何部位,局部或轉(zhuǎn)移性的NB可在無干預(yù)情況下自發(fā)消退,但大齡兒童即使經(jīng)過臨床治療仍可死于該病,約占所有兒童癌癥死亡病例的15%[1-2]。魚藤素是一種黃酮類化合物,可以有效抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ酶的活力[3]。近年的研究顯示,魚藤素對多種腫瘤,如非小細胞肺癌、肝癌、胃癌等,具有良好的抗癌活性[4-6]。目前,有關(guān)魚藤素治療NB的研究較少,本研究以小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞Neuro-2A為實驗對象,探討魚藤素對其惡性生物學(xué)行為的影響及作用機制,為魚藤素相關(guān)藥物的研發(fā)及NB的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司);流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 試藥

魚藤素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),均購自美國Sigma公司;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);兔抗鼠細胞增殖核抗原67(antigen identified by monoclonal antibody 67,Ki67),活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase3),均購自美國Santa Cruz公司;兔抗鼠Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4),核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),β-actin抗體以及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 細胞株

小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞Neuro-2A細胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞增殖情況

取處于對數(shù)生長期的Neuro-2A細胞,調(diào)整細胞密度為1×105個·mL-1,接種至96孔板,每孔180 μL,培養(yǎng)過夜使細胞貼壁,加入不同濃度的魚藤素20 μL,使其終濃度分別為0、0.01、0.1、1、10、100、1 000 nmol·L-1,設(shè)置3個復(fù)孔,培養(yǎng)48 h。每孔加質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT 20 μL,孵育4 h后棄上清,每孔加DMSO 150 μL,室溫避光孵育5 min。用酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度值A(chǔ),實驗重復(fù)3次,計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組A值÷對照組A值)×100%。應(yīng)用Graphpad Prism7軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50),并將其作為后續(xù)實驗的干預(yù)濃度。另取細胞設(shè)置對照組、魚藤素組、LPS組和魚藤素+LPS組,魚藤素組、LPS組分別加入15.6 nmol·L-1魚藤素和質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的LPS,魚藤素+LPS組先加入15.6 nmol·L-1魚藤素作用1 h,再加入質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的LPS,對照組加入等體積細胞培養(yǎng)液作用48 h,檢測細胞相對活力。細胞相對活力=實驗組A值/對照組A值。

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

收集各組細胞,調(diào)整細胞密度為5×105個·mL-1,用PBS清洗2次,加入Binding Buffer 195 μL重懸細胞,加入Annexin V-FITC 5 μL,混勻后加入PI 10 μL,室溫避光孵育15 min,用流式細胞儀檢測,用CellQuest軟件分析細胞凋亡率,實驗重復(fù)3次。

2.3 RT-PCR檢測TLR4/NF-κB通路相關(guān)基因mRNA的表達水平

收集各組細胞,用PBS清洗2次,用Trizol試劑提取細胞總RNA,用超微量分光光度計檢測其濃度和純度。

反轉(zhuǎn)錄體系:5×Mix 4 μL,RNA 1 μg,加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)程序:25 ℃,10 min;42 ℃,30 min;85 ℃,5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至1 mL作為cDNA。

熒光定量PCR反應(yīng)體系:2×SYBR Green Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板cDNA 2 μL,RNase-free ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性60 s;95 ℃,15 s;60 ℃,15 s;72 ℃,45 s,共循環(huán)40次。目的基因RT-PCR引物用Primer3.0軟件設(shè)計,序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.4 Western blot檢測蛋白表達水平

收集各組細胞,加入RIPA裂解液后于冰上孵育0.5 h,以3 000 r·min-1(離心半徑10 cm)4 ℃離心5 min,取上清,用BCA法檢測蛋白濃度。加5×SDS loading buffer,金屬浴95 ℃加熱10 min,使蛋白變性,用體積分數(shù)10%的SDS-PAGE分離目的蛋白,用轉(zhuǎn)膜儀將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用質(zhì)量濃度50 g·L-1的脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入1∶1 000稀釋的Ki67、cleaved-caspase3、TLR4、NF-κB p65和p-p65抗體,4 ℃孵育過夜,用TBST洗膜3次,加入1∶2 000稀釋的經(jīng)HRP標記的二抗,室溫孵育1 h,用TBST洗膜3次,滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,于暗室曝光顯影,用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 魚藤素對Neuro-2A細胞的生長抑制作用

不同濃度的魚藤素作用于Neuro-2A細胞48 h后,細胞的生長受到明顯抑制,隨著魚藤素濃度的升高,細胞的存活率降低(P<0.05)。魚藤素作用48 h對Neuro-2A細胞的IC50為15.6 nmol·L-1,后續(xù)實驗選擇15.6 nmol·L-1魚藤素進行處理。結(jié)果見表2。

表2 各組細胞存活率的比較

3.2 各組Neuro-2A細胞相對活力的比較

細胞相對活力組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組細胞的相對活力降低,LPS組細胞的相對活力增強(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組細胞的相對活力增強(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組細胞的相對活力降低(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組細胞相對活力的比較

3.3 各組Neuro-2A細胞凋亡率的比較

細胞凋亡率組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組細胞的凋亡率升高,LPS組細胞的凋亡率降低(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組細胞的凋亡率降低(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組細胞的凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組細胞凋亡率的比較

3.4 各組Neuro-2A細胞中TLR4、NF-κB mRNA表達水平的比較

比較各組細胞TLR4 mRNA的相對表達量,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組TLR4 mRNA的相對表達量降低,LPS組升高(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組升高(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組降低(P<0.05)。各組細胞NF-κB mRNA的相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組細胞TLR4、NF-κB mRNA表達水平的比較

3.5 各組細胞蛋白表達水平的比較

比較各組細胞Ki67、cleaved-caspase3、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量降低,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量升高(P<0.05),LPS組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量升高,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量降低(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量升高,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量降低(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量降低,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量升高(P<0.05),各組細胞NF-κB p65蛋白的相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表6和圖1。

表6 各組細胞蛋白表達水平的比較

圖1 各組細胞Ki67、cleaved-caspase3和TLR4/NF-κB通路蛋白的表達水平

4 討論

NB是一種胚胎惡性腫瘤,可影響兒童早期腎上腺髓質(zhì)和椎旁交感神經(jīng)節(jié)的正常發(fā)育,占所有兒童期惡性腫瘤的8%～10%,其起源于神經(jīng)嵴的腎上腺嗜鉻細胞和交感神經(jīng)元,具有基因組異常、腫瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性等生物學(xué)特征[7-8]。ACKERMANN S等[9]根據(jù)NB基因組測序結(jié)果及分子特征將其分為端粒維持陰性和陽性2種表型。NB的發(fā)病機制包括原癌基因激活、擴增,抑癌基因失活或雜合性缺失,部分基因(如神經(jīng)生長因子)表達失控,神經(jīng)生長因子及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(酪氨酸激酶受體介導(dǎo)的細胞信號途徑)異常,腫瘤細胞惡性增殖、凋亡失常等。由于NB原發(fā)腫瘤小、惡性程度高、進展快,由于診斷時多為中晚期且NB部分侵襲性和高危NB患者療效差、預(yù)后不佳,故也被稱為兒童腫瘤之王。NB的臨床治療手段包括手術(shù)、放療、化療、免疫治療、造血干細胞移植以及多方式聯(lián)合治療等,但治療效果仍不理想,5年生存率僅為70%,其中,高危NB患者的治愈率低于40%[10]。因此,尋找低毒、高效、溫和的新藥物對提高NB的治療效果、改善患者預(yù)后意義重大。

魚藤素是一種從魚藤屬或灰葉屬植物中提取的天然化合物,具有多種生物學(xué)效應(yīng),藥理學(xué)研究證實,魚藤素可通過阻滯細胞周期,誘導(dǎo)細胞凋亡,抑制血管生成,阻礙細胞遷移、侵襲以及調(diào)控新陳代謝等發(fā)揮抑瘤作用[11]。WANG A等[12]研究發(fā)現(xiàn),魚藤素可以誘導(dǎo)p53上調(diào)的凋亡調(diào)節(jié)物介導(dǎo)的肺癌細胞凋亡并增強其對阿霉素的敏感性。ZHENG W等[13]研究表明,魚藤素可以抑制人胰腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲,誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。LI W等[14]研究顯示,魚藤素通過下調(diào)B細胞特異性小鼠白血病病毒插入位點1基因的表達,抑制體內(nèi)和體外非小細胞肺癌細胞的生長。本研究選取處于對數(shù)生長期的小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞Neuro-2A,經(jīng)魚藤素處理后發(fā)現(xiàn),細胞存活率降低、凋亡率升高、細胞增殖標志蛋白Ki67的表達下調(diào)、cleaved-caspase3蛋白的表達上調(diào),提示魚藤素可以抑制小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

TLR亞型TLR4是一種重要的模式識別受體,可以識別病原相關(guān)分子模式并與其他輔助受體結(jié)合形成復(fù)合物傳遞信號,經(jīng)過系列信號級聯(lián)反應(yīng)使核因子κB抑制劑激酶活化,降解核因子κBα,并釋放轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核,刺激下游信號分子的表達[15]。NF-κB與炎癥因子、細胞增殖、細胞凋亡以及細胞外基質(zhì)交聯(lián)密切相關(guān),參與多種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),NF-κB p65、NF-κB p50是其常見的作用形式[16-17]。FEI W等[18]研究顯示,板栗殼提取物可通過調(diào)控TLR4/NF-κB途徑抑制肝癌細胞增殖,減輕炎癥反應(yīng)。ZHOU W等[19]研究發(fā)現(xiàn),半乳糖凝集素3可通過激活TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進肺腺癌細胞增殖。此外,ZHANG R等[20]研究表明,穿心蓮內(nèi)酯可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制人結(jié)腸癌細胞增殖,并誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,魚藤素可下調(diào)Neuro-2A細胞TLR4基因的轉(zhuǎn)錄,下調(diào)TLR4、p-p65蛋白的表達,而TLR4/NF-κB通路激動劑LPS則表現(xiàn)相反的作用效果。用魚藤素和激動劑同時處理Neuro-2A細胞后,激動劑對通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的促進作用被逆轉(zhuǎn),表明魚藤素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路,調(diào)控增殖、凋亡相關(guān)基因的表達,抑制小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞株Neuro-2A的增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述,魚藤素可以抑制Neuro-2A細胞的增殖,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路、調(diào)控細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān),為魚藤素相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于NB的臨床治療提供理論支持。