何 龍,葛占洲,伍永權,郭馬瓏

1.濮陽市中醫(yī)醫(yī)院骨五科,濮陽 457000;2.河南省洛陽正骨醫(yī)院骨科,鄭州 450000

創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎常發(fā)生于踝關節(jié)和膝關節(jié),是殘疾的重要原因之一[1]。目前由踝部骨折引起的創(chuàng)傷性關節(jié)炎是常見的踝關節(jié)骨關節(jié)炎,在臨床上內(nèi)踝骨折脫位尤為常見[2]。目前治療踝關節(jié)骨關節(jié)炎的主要方案為保守治療和手術治療[3]。青藤堿是清風藤中主要的有效成分,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。青藤堿在臨床主要用于治療類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)疾病等[4]。青藤堿可通過調(diào)節(jié)抗炎因子的表達、抑制炎癥反應,從而改善踝關節(jié)部位的病變[5]。研究表明,青藤堿通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路,發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可抑制骨關節(jié)炎,對關節(jié)軟骨具有保護作用。本實驗通過外力進行大鼠踝關節(jié)脫位骨折構建大鼠踝關節(jié)骨關節(jié)炎模型,以揭示青藤堿改善踝關節(jié)骨關節(jié)炎的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

164-5056型電泳儀(美國Bio-Rad公司);Multiskan Sky酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司);Light Ccler Ly C480型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(瑞士羅氏公司);MoticBA 210型生物顯微鏡(北京汗盟紫星儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥

青藤堿(麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司);細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司);質量濃度為4 g·mL-1的多聚甲醛(濟南百博生物技術股份有限公司);戊巴比妥鈉(上海信裕生物科技有限公司);番紅O(北京博潤萊特科技有限公司);兔抗大鼠CC類趨化因子配體2(CC-chemokine ligand 2,CCL2,貨號ab100777),Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen,COL Ⅱ,貨號ab188570),軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP,貨號ab260037),磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K,貨號ab154598),p-PI3K(貨號ab278545),蛋白激酶B(protein kinase B,Akt,貨號ab126433),p-Akt(貨號ab38449)和GAPDH(貨號ab8245)一抗和山羊抗兔IgG(貨號ab150077),均購自美國Abcam公司;超敏發(fā)光液(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠50只,12周齡,體質量(230±10) g,許可證號SCXK(京)2016-0011,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法

2.1 分組和建模

隨機將50只SD大鼠分為5組:空白組、模型組、青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組,每組10只。SD大鼠于動物房適應性飼養(yǎng)1周后,5組均用質量濃度為3 mg·mL-1的戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉。用體積分數(shù)75%的乙醇溶液消毒雙側踝關節(jié)后,于內(nèi)踝處自下而上切開皮膚,分離皮下筋膜,用1 mL注射器制做的拉鉤將肌腱向后側牽拉。將小骨鑿與角度固定器組合后置于脛骨遠端,用中等力度將骨鑿敲入內(nèi)踝,明顯感覺到落空感后,即內(nèi)踝骨折。用3-0線縫合傷口后,將足部內(nèi)翻造成脫位后,立即復位[7]。根據(jù)成人用藥劑量(青藤堿2 mL)用Meeh-Rubner公式計算人鼠等效劑量,設立青藤堿高(12.5 mg·kg-1)、中(8 mg·kg-1)、低劑量組(2 mg·kg-1)[8]。大鼠手術1 d后,空白組和模型組于踝關節(jié)注射0.1 mL生理鹽水,青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿高劑量組每天于踝關節(jié)分別注射青藤堿2、8、12.5 mg·kg-1,處理6周。

2.2 番紅O染色與評分

所有大鼠安樂死后,分別將每組大鼠 (n=5)的右側踝關節(jié)分離取出,于福爾馬林中固定48 h后,置于乙二胺四乙酸中脫鈣6周,再將每個踝關節(jié)正中冠狀切成2個部分,進行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋及切片后,進行番紅O染色。在光學顯微鏡下觀察各組大鼠踝關節(jié)的病理學變化。

2.3 ELISA檢測

分別向每組大鼠 (n=5)的右踝關節(jié)囊注入100 μL生理鹽水,將踝關節(jié)做5次屈伸運動后,用1 mL注射器吸出關節(jié)液,置于-80 ℃保存。檢測前,取出關節(jié)液以1 000 r·min-1離心30 min后,取上清液。上清液和PBS按照1∶1混合后,根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作,將對照品梯度稀釋后,每組設置5個復孔,依次加入100 μL樣品,孔板覆膜后于37 ℃孵育1 h后,棄去上清液,依次加入抗體工作液和酶結合液,覆膜后于37 ℃孵育30 min。加入顯色液,避光孵育10 min,加入終止液,放入酶標儀檢測各孔在波長450 nm處的A值。

2.4 real-time PCR檢測

用Trizol法分別提取各組大鼠左踝關節(jié)軟骨組織的總RNA。反轉錄合成cDNA(反轉錄條件:37 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min)。隨后在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)上,對包含cDNA、引物和SYBR-Green qPCR Master Mix的qRT-PCR混合物進行real-time PCR。擴增條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,共計40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,以2-ct法進行統(tǒng)計。real-time PCR引物序列見表1。

表1 real-time PCR引物序列

2.5 Western blot檢測

用RIPA對各組大鼠左踝關節(jié)的軟骨組織進行裂解,提取總蛋白。用BCA法檢測蛋白質濃度后,于100 ℃條件下變性。SDS-PAGE電泳分離總蛋白后,轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)。用質量濃度50 g·L-1的脫脂牛奶封閉2 h,用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20的混合物洗滌3次,每次10 min后,將其放入對應的一抗(CCL2、COL Ⅱ、COMP、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH)和一抗稀釋混懸液(1∶1 000)中,4 ℃孵育過夜。再用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20的混合物洗滌3次,放入二抗和二抗稀釋液(1∶4 000)混懸液中,室溫孵育2 h。用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20的混合物洗滌3次,將發(fā)光液滴在膜上,顯影、定影。用Image J軟件對數(shù)據(jù)進行分析,以GAPDH為內(nèi)參對蛋白表達量進行標準化。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 青藤堿對踝關節(jié)骨關節(jié)炎大鼠踝關節(jié)病理形態(tài)的影響

各組大鼠踝關節(jié)的病理形態(tài)見圖1。由圖1可見,模型組、青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組大鼠的脛骨遠端及距骨軟骨表面均有不同程度的退化,如軟骨細胞的丟失、軟骨表面纖維化。與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組軟骨表面的病理改變均有一定程度的改善。

注:A.空白組;B.模型組;C.青藤堿高劑量組;D.青藤堿中劑量組;E.青藤堿低劑量組;AC.關節(jié)軟骨;SB.松質骨;箭頭表示關節(jié)軟骨的厚度。

3.2 大鼠踝關節(jié)液中炎癥因子的表達水平

各組大鼠踝關節(jié)組織中炎性因子IL-1β、MMP-13和TNF-α含量的比較見表2。由表2可見,與空白組比較,模型組IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達水平顯著上升(P<0.05);與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達水平顯著上升(P<0.05);與青藤堿中劑量組比較,青藤堿高劑量組IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達水平顯著降低(P<0.05),而青藤堿低劑量組的變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠踝關節(jié)組織中炎性因子IL-1β、MMP-13和TNF-α含量的比較

3.3 大鼠踝關節(jié)軟骨生物標志物mRNA和蛋白的表達水平

real-time PCR和Western blot結果顯示,與空白組比較,模型組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達量顯著上升(P<0.05);與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達量顯著降低(P<0.05);與青藤堿中劑量組比較,青藤堿高劑量組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而青藤堿低劑量組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達量明顯上升(P<0.05)。結果見圖2、表3、表4。

表3 5組大鼠踝關節(jié)軟骨組織中CCL2、COL Ⅱ和COMP蛋白表達水平的比較

表4 5組大鼠踝關節(jié)軟骨組織中CCL2、COL Ⅱ和COMP mRNA表達量的比較

注:A.空白組;B.模型組;C.青藤堿高劑量組;D.青藤堿中劑量組;E.青藤堿低劑量組。

3.4 大鼠PI3K-Akt信號通路的變化

Western blot結果顯示,與空白組比較,模型組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白比值顯著升高(P<0.05);與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白比值顯著降低(P<0.05);與青藤堿中劑量組比較,青藤堿高劑量組和青藤堿低劑量組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白比值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見圖3和表5。

表5 5組大鼠踝關節(jié)組織中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白比值的比較

注:A.空白組;B.模型組;C.青藤堿高劑量組;D.青藤堿中劑量組;E.青藤堿低劑量組。

4 討論

骨關節(jié)炎是一種軟骨的慢性退行性疾病,常發(fā)生于膝關節(jié)和踝關節(jié),同時出現(xiàn)關節(jié)軟骨下骨硬化、骨質增生等問題[9-10]。踝關節(jié)骨性關節(jié)炎的臨床發(fā)病率較高,且多為繼發(fā)性,具有長期重復性,主要癥狀為踝關節(jié)的疼痛和僵硬、關節(jié)腫脹和積液[11-12]。

目前構建踝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型主要是通過切斷踝關節(jié)部分韌帶,而內(nèi)踝骨折及內(nèi)踝骨折伴脫位是導致踝關節(jié)骨性關節(jié)炎的主要原因[13],課題組前期建立了骨折伴脫位大鼠模型,結果顯示,模型組大鼠的踝關節(jié)出現(xiàn)軟骨細胞丟失和基質丟失,表面粗糙并且出現(xiàn)纖維樣改變,踝關節(jié)液中炎癥因子IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達水平上升,并且CCL2、COL Ⅱ、COMP蛋白和mRNA的表達量也明顯升高,這與臨床報道的結果一致,故認為踝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型構建成功。

青藤堿是青風藤的主要成分,具有抗炎、抑制免疫等作用,其最主要的優(yōu)勢是不良反應較少、安全系數(shù)高、不產(chǎn)生藥物依賴性[14]。研究表明,青藤堿可以抑制關節(jié)液中MMP-13和COMP的表達,從而緩解軟骨退變的進程[15]。青藤堿可抑制膝關節(jié)炎的軟骨中自噬,抑制PI3K-Akt等炎癥信號通路,從而發(fā)揮抗炎作用[16]。研究表明,青藤堿具有強大的抗炎作用,并且毒性小,具有較大的開發(fā)潛力。青藤堿抑制膝骨關節(jié)炎的作用已在實驗研究中得到證實[17],炎性反應是骨關節(jié)炎病理生理變化的重要特征,炎性因子的表達量增加是加速骨關節(jié)炎軟骨退化的重要因素。本研究的結果顯示,高、中、低劑量的青藤堿均可以改善踝關節(jié)的病理形態(tài),使軟骨細胞丟失量減少,并使纖維樣減輕。與模型組比較,青藤堿高、中、低劑量組大鼠踝關節(jié)液中炎癥因子IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達水平降低,同時軟骨中CCL2、COL Ⅱ、COMP蛋白和mRNA的表達量降低,與文獻報道的青藤堿的效果一致。文獻報道,PI3K-Akt信號通路與骨關節(jié)炎密切相關,認為其是抗炎和抗軟骨細胞凋亡的重要通路[18-19]。PI3K-Akt信號通路被激活后,加重骨關節(jié)炎的軟骨退化[20]。青藤堿高、中劑量可顯著抑制PI3K-Akt信號通路,從而下調(diào)CCL2、COL Ⅱ、COMP的表達水平。

綜上所述,青藤堿可抑制PI3K/Akt信號通路的轉導,抑制炎性因子IL-1β、MMP-13、TNF-α、CCL2、COLⅡ、COMP的表達,從而改善踝關節(jié)的軟骨退化,為臨床治療踝關節(jié)骨關節(jié)炎提供參考。