農(nóng)新維,王 嬋,黃雄梅,韋紅言,王熙珍

培力(南寧)藥業(yè)有限公司,南寧 530007

銀翹散出自《溫病條辨》,此方由金銀花、連翹、荊芥、淡豆豉、薄荷、淡竹葉、牛蒡子、桔梗、甘草和蘆根10味中藥組成,具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效[1],用于外感風(fēng)寒、發(fā)熱頭痛、口干咳嗽、咽喉疼痛、小便短赤等的治療[2]?，F(xiàn)代臨床上主要將其用于流感、肺炎等疾病的治療,也普遍用于內(nèi)科、耳鼻喉科、外科、眼科、兒科、感染科及皮膚科多種疾病的治療[3-7]。銀翹散配方顆粒是以銀翹散為基礎(chǔ),采用現(xiàn)代工藝進(jìn)行水提取、濃縮、干燥、制粒而成的復(fù)方顆粒劑。目前關(guān)于銀翹散整體評(píng)價(jià)的研究主要集中在中藥散劑、煎液的指紋圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定等方面[8-20],尚無采用特征圖譜控制銀翹散配方顆粒質(zhì)量的報(bào)道。本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)構(gòu)建銀翹散配方顆粒特征圖譜,對(duì)共有特征峰進(jìn)行來源歸屬與化學(xué)成分指認(rèn),明確了銀翹散配方顆粒的主要化學(xué)成分組成;通過對(duì)銀翹散合煎配方顆粒、單煎配方顆粒及散劑之間的相關(guān)性進(jìn)行研究,探索三者在化學(xué)成分方面的差異性;用特征圖譜對(duì)銀翹散配方顆粒進(jìn)行整體質(zhì)量評(píng)價(jià)研究,為銀翹散配方顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫科技有限公司);XPE205DR型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

綠原酸(批號(hào)110753-201314,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.6%),咖啡酸(批號(hào)110885-200102,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%),連翹酯苷A(批號(hào)111810-201707,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.2%),連翹酯苷B(批號(hào)111811-201603,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.6%),3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(批號(hào)111782-201204,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.2%),4,5-二-O-咖啡?；鼘幩?批號(hào)111894-201706,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.3%),連翹苷(批號(hào)110821-201213,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.3%),牛蒡苷(批號(hào)110819-201309,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.7%),甘草酸銨(批號(hào)110731-201720,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;新綠原酸(批號(hào)MUST-13013001,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%),隱綠原酸(批號(hào)MUST-14041410,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%),均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司;連翹酯苷I(批號(hào)21022509,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%),連翹酯苷H(批號(hào)21022507,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%),均購(gòu)自成都格利普生物科技有限公司;銀翹散配方顆粒及單味配方顆粒均由培力(南寧)藥業(yè)有限公司提供;乙腈(色譜純,默克股份兩合公司);乙醇(分析純,廣東光華科技股份有限公司);磷酸(分析純,重慶川東化工有限公司);水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

儀器:Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)。色譜柱:Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相:乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脫:0～8 min,5%A;8～14 min,5%A→10%A;14～30 min,10%A→14%A;30～55 min,14%A→16%A;55～65 min,16%A→24%A;65～80 min,24%A→28%A;80～100 min,28%A→80%A)。流速:1.0 mL·min-1。柱溫:25 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm。進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷I、連翹酯苷H、連翹酯苷A、連翹酯苷B、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、4,5-二-O-咖啡?；鼘幩帷⑦B翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨對(duì)照品適量,加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為39.01、45.21、42.09、22.63、50.18、47.60、42.09、58.66、44.52、31.01、17.56、23.60、48.54 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品適量,研細(xì),稱取粉末約0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次的銀翹散配方顆粒,按2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以13號(hào)峰為S峰,計(jì)算各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。計(jì)算得各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于0.73%和2.82%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以13號(hào)峰為S峰,計(jì)算各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。計(jì)算得各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于0.38%和1.46%,表明儀器的精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液,分別于0、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以13號(hào)峰為S峰,計(jì)算各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。計(jì)算得各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于0.64%和2.09%,表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4耐用性實(shí)驗(yàn) 取同一批次的銀翹散配方顆粒,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在2.1項(xiàng)下色譜條件的基礎(chǔ)上,采用不同檢測(cè)柱溫(25±5) ℃、流速(1.0±0.1) mL·min-1檢測(cè)同一份供試品溶液,考察色譜條件的耐用性。以13號(hào)峰為S峰,計(jì)算各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。計(jì)算得各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于2.33%和2.70%,且分離度均良好,表明方法柱溫與流速的耐用性良好。

2.3.5銀翹散配方顆粒特征圖譜的建立 按2.2.2項(xiàng)下方法制備10批銀翹散配方顆粒供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定特征圖譜。結(jié)果見圖1。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”對(duì)該10批銀翹散配方顆粒特征圖譜進(jìn)行匹配,生成對(duì)照特征圖譜。共選擇20個(gè)重復(fù)性良好,響應(yīng)值較高的色譜峰作為共有特征峰。

注:S1～S10為10批銀翹散配方顆粒供試品溶液;1～20號(hào)峰為10批銀翹散配方顆粒的20個(gè)共有峰。

其中13號(hào)峰響應(yīng)值較高,分離良好,保留時(shí)間適中,故將13號(hào)峰作為S峰,計(jì)算各共有特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,并計(jì)算相似度。結(jié)果見表1、表2、表3。10批銀翹散配方顆粒共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間較一致,RSD值小于1.30%;共有特征峰相對(duì)峰面積的差異較大,RSD值小于27.43%;相似度均大于0.90。

表1 10批銀翹散配方顆粒特征圖譜的相對(duì)保留時(shí)間

表2 10批銀翹散配方顆粒特征圖譜的相對(duì)峰面積

表3 10批銀翹散配方顆粒特征圖譜的相似度

2.3.6特征圖譜色譜峰歸屬與鑒定 取銀翹散配方顆粒及各單味配方顆粒,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,對(duì)銀翹散配方顆粒與單味顆粒中各色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,20個(gè)特征峰來源于連翹、金銀花等7味藥材。另取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè),通過與混合對(duì)照品色譜圖保留時(shí)間及紫外光譜進(jìn)行比較,確認(rèn)銀翹散配方顆粒圖譜中13個(gè)共有特征峰,根據(jù)紫外光譜推斷出5個(gè)未指認(rèn)特征峰的化合物類型。結(jié)果見圖2、圖3、表4。

表4 銀翹散配方顆粒共有特征峰的來源歸屬及鑒定結(jié)果

注:A.供試品溶液;B.混合對(duì)照品溶液;4.新綠原酸;8.綠原酸;9.隱綠原酸;10.咖啡酸;11.連翹酯苷I;12.連翹酯苷H;13.連翹酯苷A;14.連翹酯苷B;15.3,5-O-二咖啡?；鼘幩?16.4,5-二-O-咖啡?；鼘幩?17.連翹苷;18.牛蒡苷;20.甘草酸銨;1、2、3、5、6、7、19號(hào)峰為10批銀翹散配方顆粒的其余7個(gè)共有峰。

注:1～20號(hào)峰為10批銀翹散配方顆粒的20個(gè)共有峰。

2.3.7相關(guān)性研究 取各單味配方顆粒按銀翹散處方配制成銀翹散單味配方顆?；旌蠘悠?另取銀翹散各味藥材,粉碎成細(xì)粉,過篩,按處方混勻制成銀翹散藥材散劑樣品。上述樣品分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,對(duì)比銀翹散配方顆粒、單味配方顆?；旌蠘悠芳般y翹散散劑主要共有特征峰的變化。結(jié)果見圖4。通過比較特征圖譜,發(fā)現(xiàn)三者檢測(cè)出的特征色譜峰數(shù)量和相對(duì)保留時(shí)間基本一致,所含主要化學(xué)成分大致相同,銀翹散配方顆粒與單味配方顆?；旌蠘悠返南嗨贫葹?.951,從化學(xué)成分角度分析,合煎制備工藝銀翹散配方顆粒與單煎制備工藝配方顆粒混合樣品無顯著差異。

注:A.銀翹散配方顆粒;B.單味配方顆?；旌蠘悠?C.銀翹散散劑;1～20號(hào)峰為10批銀翹散配方顆粒的20個(gè)共有峰。

但銀翹散散劑的部分特征峰高于銀翹散配方顆粒與單味配方顆?；旌蠘悠?說明銀翹散散劑與配方顆粒存在較顯著的差異。初步分析是由于銀翹散散劑為藥材粉末,而配方顆粒經(jīng)過水煎煮,在水煎煮的過程中各特征峰成分的溶出規(guī)律存在差異,也存在較復(fù)雜成分相互轉(zhuǎn)化機(jī)制。

3 討論

3.1 色譜條件及提取方式篩選

對(duì)不同流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)和供試品溶液的制備方法進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示,以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液為流動(dòng)相體系梯度洗脫得到的色譜圖基線較平穩(wěn)且分離效果好;在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果顯示,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm時(shí),特征峰的數(shù)量最多且各特征峰響應(yīng)值較為均衡;用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液進(jìn)行超聲提取和回流提取,結(jié)果顯示,以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液超聲提取30 min得到的色譜圖能夠最大限度地反映樣品的整體特征。

3.2 特征色譜峰的歸屬

銀翹散配方顆粒的20個(gè)特征峰來源于連翹、金銀花等7味藥材,但未發(fā)現(xiàn)來源于桔梗、蘆根、淡豆豉的顯著色譜峰,推測(cè)可能因?yàn)樵?味藥材的水提成分含量較低、紫外吸收較弱,故難以檢測(cè)到。進(jìn)一步研究將考慮采用薄層色譜分析法等方法對(duì)該3味藥材進(jìn)行定性質(zhì)量控制。

3.3 銀翹散合煎、單煎及散劑的相關(guān)性

銀翹散配方顆粒合煎制備工藝與單煎制備工藝的特征圖譜一致性良好,而銀翹散散劑與配方顆粒特征圖譜的部分特征峰存在較明顯的差異,但銀翹散散劑與配方顆粒的藥理活性、臨床療效的相關(guān)性及差異性尚有待進(jìn)一步研究。

10批銀翹散配方顆粒特征圖譜的色譜峰整體上基本一致,表明銀翹散配方顆粒提取工藝及制劑工藝較為穩(wěn)定,保證了制劑成品質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。采用特征圖譜進(jìn)行整體評(píng)價(jià),對(duì)銀翹散配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了全面提升,能更好地對(duì)銀翹散配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制。