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        孕期慢性應激通過胎盤GC 屏障致子代情緒損傷的機制

        2022-06-08 07:10:16劉紅婭馬淑琴陳小惠戚發(fā)秋付有娟關素珍
        寧夏醫(yī)科大學學報 2022年3期
        關鍵詞:子鼠母鼠子代

        劉紅婭, 馬淑琴, 陳小惠, 戚發(fā)秋, 趙 楓, 付有娟, 關素珍

        (1.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院,銀川 750004; 2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室,銀川 750004;3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院,銀川 750004)

        隨著社會經濟的發(fā)展,兒童神經精神性疾病,如焦慮癥、孤獨癥等受到社會的廣泛關注。越來越多的研究[1]表明,子代神經精神類疾病的發(fā)病與母親孕期應激刺激有極大的聯(lián)系。孕期長期處于應激狀態(tài)會引起胎兒暴露于過量糖皮質激素(glucocorticoid,GC)[2],主要為皮質醇,通過胎盤進入宮內,引起胎兒下丘腦-垂體-腎上腺(The hypothalamic pituitary adrenal,HPA)軸改變,導致子代情緒和認知發(fā)育異常[3]。在正常妊娠中,胎兒的GC 暴露是由胎盤GC 屏障決定的,胎盤GC 屏障需要11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2,11β-HSD2)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)共同調節(jié),以保證適量卻不超量的GC。11β-HSD2 可將GC 從有活性狀態(tài)轉化為無活性狀態(tài)[4],P-gp 能逆濃度將GC轉運到母體面[5],且GC 受體亞家族3C 組成員1(Nuclear Receptor Subfamily 3,Group C,Member 1,NR3C1)在HPA 軸功能紊亂過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。目前,孕期慢性應激對胎盤GC 屏障的具體調節(jié)機制尚不清楚。本研究擬建立孕期慢性應激大鼠模型,觀察子鼠情緒變化,通過檢測胎盤GC 屏障相關基因的表達,探討GC 屏障與子代情緒之間的相關性。

        1 資料與方法

        1.1 實驗動物

        選擇成年SPF 級未曾受孕的80~90 日齡SD雌性大鼠32 只,體質量(200±20)g,隨機分為模型組和對照組,每組16 只。模型組為單籠飼養(yǎng),對照組4 只/籠飼養(yǎng)。90 日齡以上雄鼠24 只,體質量(220±20)g,分為模型交配組16 只和對照交配組8 只,4 只/籠飼養(yǎng),雄鼠只為交配所用。均購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證號:SYXK(寧)2020-0001。本研究經寧夏醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準,編號為IACUC-NYLAC-2020068。

        1.2 主要試劑和儀器

        131I 皮質醇放射免疫試劑盒(北京北方生物技術研究所,中國),蔗糖(北京化學試劑,中國),β-actin 抗體(Santa,美國),11β-HSD2 一抗(Novus,美國),P-gp 一抗(abcam,美國),NR3C1 一抗(abcam,美國),山羊抗兔IgG 二抗(affnity,中國)等;電泳儀(北京市六一儀器廠),Smart 3.0 小動物行為學視頻記錄與分析系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,中國)。

        1.3 孕期慢性應激模型建立

        1.3.1 模型建立方法 適應性飼養(yǎng)7 d 后,選擇慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)建立孕期CUMS 動物模型[8]。根據實驗室條件選擇應激方式:(1)24 h 擁擠環(huán)境;(2)24 h 潮濕環(huán)境(濕度60%~70%);(3)5 min熱水游泳(45 ℃);(4)30 min 搖晃鼠籠;(5)行為束縛2 h;(6)5 min 冰水??;(7)夾尾2 min(距尾根部1 cm 處)。利用隨機數字表法將7 種刺激方式隨機安排到28 d 內,每天1 種,應激完成后放回原飼養(yǎng)籠中。

        在應激周期第7 天,模型組雌鼠與模型交配組雄鼠(1∶1)進行合籠交配,次日早晨檢查雌鼠陰栓(或陰道涂片),明確妊娠后,將雌雄鼠分離,模型組孕鼠繼續(xù)單籠飼養(yǎng),在合籠過程中,應激照常進行。對照組雌鼠與對照交配組雄鼠(2∶1)進行合籠交配,確定妊娠后,雌雄分離,對照組孕鼠4 只/籠,在孕18 d 開始單籠飼養(yǎng)。

        1.3.2 確認模型成功與否 利用行為學變化及血漿皮質酮來確認孕期CUMS 大鼠模型的成功建立[9-10]。在應激前1 d 和應激第1、7、14、21、28天內眥靜脈采血收集血漿,-80 ℃冰箱冷凍待測。同時期進行曠場實驗(open field test,OFT)、蔗糖偏好實驗(sucrose preference test,SPT)測定母鼠的行為學。

        1.4 子鼠分組及樣品收集

        確認懷孕的第18 天,每組各取8 只孕鼠進行剖宮收集胎盤,-80 ℃冰箱冷凍保存。其余8只孕鼠分娩后獲得子鼠,所有子鼠于一周內全部娩出,子鼠出生的當天記為PND0(postnatal day 0,PND0),PND21 斷乳,每組按每籠的分娩只數及性別比例從不同窩別中隨機抽取16 只子鼠(雌雄各半),記為對照子鼠組和模型子鼠組,雌雄分籠,4 只/籠飼養(yǎng)。PND28 與PND42,記錄子鼠體質量并內眥靜脈采血收集血漿,-80 ℃冰箱冷凍待測。

        1.5 指標測定和方法

        1.5.1 血漿皮質酮測定 利用131I 皮質醇放射免疫試劑盒測定血漿皮質醇濃度,根據公式:C 皮質酮=50 × C 皮質醇,得到皮質酮濃度。

        1.5.2 母鼠行為學測定 (1)OFT[11]:選擇OFT反映箱進行實驗,呈立方體(100 cm×100 cm×50 cm),周壁為黑色,底部由25 等分的方塊組成。每只大鼠測定時間為5 min,水平運動得分以動物經過的底面塊數計數,動物3 爪以上跨入方格內記為1 分;垂直運動得分以直立次數計數,1 次記為1 分。并記錄清潔運動次數(大鼠做洗臉樣動作)和糞便粒數,每只大鼠開始前徹底清潔敞箱。(2)SPT[12]:分為適應訓練部分和測試部分。首先訓練大鼠適應含糖飲水,每籠放置2 個裝有1%蔗糖水的水瓶自由飲水24 h,第2 天將其中的一瓶換成純水,適應結束后,禁食禁水24 h,次日給予1 瓶1%蔗糖水,1 瓶純水,自由飲水1 h后稱重。其余時間給予正常飲食。1%蔗糖偏愛百分比=蔗糖水消耗/總液體消耗×100%。

        1.5.3 子鼠行為學測定 在PND42 開始,進行子鼠行為學的測定,OFT 和SPT 具體方法同母鼠行為學測定,連續(xù)測量3 d,取平均值。在PND45時,開始懸尾實驗(tail suspension test,TST)[13],具體操作:將大鼠呈倒懸狀態(tài)固定在TST 箱上(距子鼠尾尖約5 cm),確保子鼠頭部距臺面約為20 cm。主要指標為6 min 內的“靜止”時間,表現(xiàn)出“失望”狀態(tài),并追蹤子鼠的掙扎軌跡。連續(xù)測定3 d,取平均值。

        1.5.4 胎盤GC 屏障相關蛋白11β-HSD2、NR3C1、P-gp 表達的測定 Western blot 測定胎盤GC 屏障相關蛋白11β-HSD2、NR3C1、P-gp 的含量,每100 mg 待測胎盤組織中加入0.8 mL RIPA Lysis Buffer 制備成勻漿后,離心,取上清,采用BCA 法進行蛋白定量。上樣緩沖液與樣品按5∶1 體積比例進行混合,上樣蛋白50 μg,進行凝膠蛋白電泳,采用濕轉法將凝膠轉移至0.45 μm 的PVDF膜,封閉1 h,加入一抗,4 ℃過夜,回收一抗,加入二抗,顯色后以目的蛋白11β-HSD2、P-gp、NR3C1 與β-actin 蛋白的光密度(OD)的比值表示目的蛋白的相對表達量。

        1.6 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用t 檢驗;母鼠相關數據的比較采用重復測量的方差分析;相關性分析采用Pearson 相關分析。檢驗水準α=0.05,雙側檢驗。

        2 結果

        2.1 孕期慢性應激致母鼠血漿皮質酮水平增高

        經重復測量方差分析,慢性應激對母鼠皮質酮水平有影響(F=41.399,P<0.05),模型組皮質酮水平隨應激時間的變化而變化(F=4.440,P<0.001),分組與時間點的交互作用差異無統(tǒng)計學意義(F=1.134,P>0.05)。同一時間點兩組比較發(fā)現(xiàn),模型組血漿皮質酮濃度在應激第14、21、28天均高于對照組(t14=2.412,P <0.05;t21=2.822,P<0.05;t28=2.956,P<0.05)。表明模型組母鼠在孕期處于應激狀態(tài),見表1。

        表1 應激對母鼠血漿皮質酮濃度的影響(±s,ng·mL-1)

        表1 應激對母鼠血漿皮質酮濃度的影響(±s,ng·mL-1)

        *P<0.05。

        組別n應激前1 d應激第1 天應激第7 天應激第14 天應激第21 天應激第28 天對照組8325.74±12.57368.31±59.20227.45±127.60285.63±81.64341.78±48.40320.43±84.76模型組8367.99±52.66388.09±77.40320.86±86.86394.02±97.41* 444.12±90.43* 463.71±107.76*?

        2.2 孕期慢性應激致母鼠行為學改變

        SPT 結果經重復測量方差分析,組間比較發(fā)現(xiàn),模型組1%蔗糖偏愛百分比與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(F組間=15.053,P<0.05;F組內=1.547,P>0.05;F交叉=2.224,P>0.05),同一時間點兩兩比較發(fā)現(xiàn),模型組1%蔗糖偏愛百分比在應激第 14、21 天均低于對照組(t14=-3.922,P<0.05;t21=-2.870;P<0.05),見圖1。模型組蔗糖消耗量與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(F組間=2.345,P<0.05;F組內=72.802,P<0.05;F交叉=3.669,P<0.05),進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn):在應激14 d 模型組蔗糖水消耗量、液體總消耗量均低于對照子鼠組(t14蔗糖消耗量=-4.025,P<0.05;t14液體總消耗量=-2.484,P<0.05)。

        OFT 結果經重復測量方差分析,組間比較發(fā)現(xiàn),模型組水平運動得分與對照組差異有統(tǒng)計學意義(F組間=4.368,P<0.05;F組內=4.384,P<0.05;F交叉=4.824,P>0.05),模型組垂直運動得分與對照組存在差異(F組間=4.215,P<0.05;F組內=5.649,P<0.05;F交叉=1.638,P>0.05),進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn),在應激第7、21、28 天模型組水平得分均低于對照組(t7=-4.018,P<0.05;t21=-0,664,P<0.05;t28=-2.444,P<0.05),在應激第21 天模型組垂直運動得分低于對照組(t21=-2.447,P<0.05),見圖1。

        圖1 孕期慢性應激致母鼠行為學改變

        2.3 孕期慢性應激對子代的影響

        2.3.1 孕期慢性應激致子代體質量降低 與對照子鼠組相比,模型子鼠組PND28、PND42 體質量均低于對照子鼠組(P 均<0.05),見表2。

        2.3.2 孕期慢性應激致子代血漿皮質酮濃度升高 模型子鼠組的血漿皮質酮濃度與對照子鼠組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),在PND28 和PND42時,模型子鼠組的血漿皮質酮水平均高于對照子鼠組(P 均<0.05),見表2。

        表2 孕期慢性應激對子代體質量和血漿皮質酮的影響(±s)

        表2 孕期慢性應激對子代體質量和血漿皮質酮的影響(±s)

        組別n體質量/g血漿皮質酮/(ng·mL-1)PND28PND42PND28PND42對照子鼠組1697.29±26.87195.23±25.84413.91±53.86277.53±91.12模型子鼠組1675.69±19.26175.59±19.45504.11±132.72415.30±150.47 t 值-2.429-2.6142.5193.133 P 值0.0140.0210.0200.004

        2.3.3 孕期慢性應激致子代焦慮、抑郁樣行為 模型子鼠組的水平運動得分低于對照子鼠組(P<0.05),表明模型子鼠組較對照子鼠組的探究行為減少,處于緊張狀態(tài)。模型子鼠組的糖水消耗量、液體總消耗量和1%蔗糖偏愛百分比均低于對照子鼠組(P 均<0.05)。模型子鼠組與對照子鼠組的靜止時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),模型子鼠組靜止時間長于對照子鼠組,表明模型子鼠組處于失望、抑郁狀態(tài),見表3。

        表3 孕期慢性應激致子鼠行為學改變(±s)

        表3 孕期慢性應激致子鼠行為學改變(±s)

        組別nOFT/分SPTTST水平運動垂直運動 蔗糖水消耗/mL 液體總消耗/mL 1%蔗糖偏愛百分比/%靜止時間/s對照子鼠組 16 67.54±17.16 13.67±5.128.14±1.7113.21±1.7160.75±7.1752.17±38.94模型子鼠組 16 49.58±27.34 9.79±6.756.55±1.6011.73±1.7039.36±19.8998.03±56.22 t 值-2.225-1.829-2.704-2.444-4.0472.791 P 值0.0340.0770.0110.021<0.0010.009

        2.4 孕期慢性應激對子代胎盤GC 屏障相關蛋白表達的影響

        子鼠胎盤組織Western blot 條帶圖結果顯示:模型子鼠組胎盤組織GC 相關蛋白11β-HSD2、P-gp 的相對表達均低于對照子鼠組(t=2.485,P <0.05;t=2.420,P <0.05),NR3C1 的相對表達高于對照子鼠組(t=2.240,P<0.05),見圖2。

        圖2 胎盤GC 屏障相關蛋白變化

        2.5 子鼠情緒損傷與GC 屏障相關蛋白的相對表達的相關性分析

        相關性分析顯示,子鼠胎盤GC 屏障相關蛋白11β-HSD2、P-gp 的相對表達與OFT 的水平運動得分均呈正相關(P 均<0.05),與SPT 的蔗糖水消耗、1%蔗糖偏愛百分比均呈正相關(P 均<0.05),與TST 的靜止時間呈負相關(P<0.05);子鼠胎盤GC 屏障相關蛋白NR3C1 的相對表達與OFT 水平運動、垂直運動得分均呈負相關(P 均<0.05),與TST 的靜止時間呈正相關(P<0.05),與SPT 蔗糖水消耗、1%蔗糖偏愛百分比均呈負相關(P 均<0.05),見表4。

        表4 子鼠情緒損傷與胎盤GC 屏障相關蛋白的相對表達相關性分析(r 值)

        3 討論

        本研究通過建立孕期慢性應激動物模型發(fā)現(xiàn),模型組的血漿皮質酮水平在應激第14、21、28 天均較高于對照組,與文獻[14]的研究結果相似,模型組母鼠的糖水偏愛度降低,曠場試驗的活動度和探索能力均降低,與以往的研究[15]結果相似,結果提示:模型組處于應激狀態(tài)。此次造模周期為28 d,在應激第7 天合籠,母鼠在孕期以及懷孕期間都接受應激刺激,在造模過程中發(fā)現(xiàn),模型組和對照組在應激第7、14 天的血漿皮質酮水平較應激前1 d 和應激第1 天均有降低趨勢,引起這一結果的原因可能是第7 天為雌雄合籠的第1 天,第14 天合籠結束,大鼠當時所處的狀態(tài)為懷孕初期和交配期,這一時期的激素水平不穩(wěn),這一現(xiàn)象可作為后期研究的切入點進行深入研究。

        研究[16]表明,孕期長期焦慮會增加低體質量兒等不良妊娠結局的發(fā)生。本研究結果顯示,在PND28、PND42 模型子鼠組的體質量均低于同期對照子鼠組,與相關研究[17]結果一致,說明孕期慢性應激致子代體質量偏低。本研究結果表明,在PND28、PND42 模型子鼠組血漿皮質酮水平均高于對照子鼠組,有研究[18]提到,孕期受到應激刺激,會激活母親自身HPA 軸改變,產生大量的皮質醇,致使子代的皮質酮升高,影響子代的情緒、認知能力,表明孕期應激會使子代的血漿皮質酮升高。

        目前多采用OFT 來反映動物對新環(huán)境的恐懼、焦慮狀態(tài)[19]。本研究結果顯示,相對于對照子鼠組,模型子鼠組對于新鮮事物的探索行為和適應能力降低,與趙楓等[20]研究結果一致。SPT 是一種反映快感是否缺失的指標[12],結果顯示,模型子鼠組的蔗糖水消耗和1%蔗糖偏好百分比均低于對照子鼠組,表明孕期慢性應激導致子代對幸福事件的反應能力下降,與Lu 等[21]研究結果一致。STT 是反映失望情緒較經典的試驗方法[22],結果顯示,孕期慢性應激會致使子代對被迫體位的反抗能力降低,表現(xiàn)出失望、抑郁狀態(tài),與甄鳳亞等[23]研究結果類似。以上結果均表明孕期慢性應激可導致子鼠出現(xiàn)焦慮、抑郁情緒。

        母體GC 進入胎盤和胎兒是通過胎盤GC 屏障調控的,胎盤組織中11β-HSD2、P-gp 和NR3C1 含量豐富,且與胎盤GC 屏障的開放有密切關系[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn),模型子鼠組胎盤GC 屏障關鍵基因11β-HSD2 相對表達下調,表明被代謝滅活的GC 含量減少,與相關研究[26]結果相似;P-gp 的相對表達下調,表明從胎兒面外將GC 排至母體面的量減少,與以往的研究[27]一致。蛋白NR3C1 的相對表達上調,表明與GC 受體NR3C1結合的GC 含量增加,與相關研究[28]結果相似。以上結果均表明,模型子鼠組暴露于高皮質酮水平。結合相關性分析結果,孕期慢性應激子鼠情緒損傷與胎盤GC 屏障相關蛋白11β-HSD2、Pgp 的相對表達下降,NR3C1 的相對表達升高有關。正如孕期慢性應激引起機體HPA 軸持續(xù)激活,致使母體產生大量的GC,引起胎盤GC 屏障改變,影響胎兒的HPA 軸,進而影響胎兒情緒、認知等方面[29-30]。

        綜上所述,孕期慢性應激導致子鼠出現(xiàn)焦慮、抑郁情緒,其機制可能與胎盤GC 屏障關鍵調節(jié)基因11β-HSD2、P-gp 和NR3C1 的異常表達有關。近些年,孕期母體的焦慮引起胎盤GC屏障相關基因DNA 甲基化程度異常,并在出生后長期存在,最終造成胎兒HPA 軸功能失調及出生后神經行為異常的研究逐漸增多,因此,接下來我們將進一步確定胎盤GC 屏障相關基因的異常甲基化,以及甲基化終生GC 反應和HPA 軸失調致認知發(fā)育損傷的機制,這對于探究成年疾病的胎兒起源和尋找阻斷胎盤GC 屏障改變的分子靶標,具有重要的理論和實踐意義。

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