鄭 京，梁樂(lè)霞，宣倩倩，郭慧瀅，周志國(guó)，孫澤敏，左國(guó)才

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

【研究意義】疫霉菌在全球廣泛分布，包括一些破壞性侵染重要作物和森林的毀滅性病原體。卵菌綱霜霉目腐霉科疫霉屬Phytophthora［1-2］是植物病原菌中危害最大的屬之一，其中肉桂疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）是世界上最具毀滅性的植物病原菌之一［3-4］。本研究涉及到的掘氏疫霉菌（Phytophthora drechsleri）具短絨毛狀氣生菌絲體，這種氣生菌絲體能夠引起黃瓜疫病（Epidemic Disease，簡(jiǎn)稱(chēng)ED）的發(fā)生。ED 是一種土傳病害，具有較強(qiáng)的毀滅性。黃瓜在感染掘氏疫霉菌后，發(fā)病兇猛，擴(kuò)散迅速，在世界范圍內(nèi)引起嚴(yán)重危害，然而利用植物內(nèi)生菌（endophyte）與植物的互作可以防治這種病害。植物內(nèi)生菌是微生物學(xué)和植物微生態(tài)學(xué)的交叉研究領(lǐng)域，有著很好的發(fā)展前景。目前“資源節(jié)約，環(huán)境友好”已經(jīng)成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展主流，植物內(nèi)生菌的研究已經(jīng)成為生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向，該領(lǐng)域的相關(guān)研究成果不僅在微生物基礎(chǔ)研究方面具有十分重要的理論價(jià)值，而且在解決人口過(guò)快增長(zhǎng)、資源短缺、環(huán)境污染和農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展等方面也具有重要的實(shí)踐意義。

【前人研究進(jìn)展】20 世紀(jì)40 年代末，日本的黃瓜被一種疫霉菌所侵染，發(fā)生了腳腐病，經(jīng)Katsura 實(shí)地仔細(xì)觀察和深入研究，將該疫霉菌認(rèn)定為一種霉菌新種（命名為Phytophthora melonisKatsura）。1970 年代，我國(guó)的黃瓜也大面積遭遇疫病，南京農(nóng)學(xué)院植物病理教研組陸家云等對(duì)侵染我國(guó)黃瓜的疫霉屬真菌進(jìn)行了生物學(xué)及分類(lèi)學(xué)研究，表明Phytophthora melonis和Phytophthora drechsleri之間的差異極小，只是Phytophthora melonis的致病性?xún)H限于葫蘆科植物，因此認(rèn)為可以將原來(lái)在黃瓜上鑒定的病原菌重新鑒定為Phytophthora drechsleri［5］。之后便有研究者開(kāi)始利用生物方法防治由該病原菌引起的疫病。Kim等從土壤中分離得到176 株菌株，其中49 株對(duì)Phytophthora drechsleri有拮抗作用，最明顯的為腸桿菌Enterobacter asburiae［6］。疫霉菌通常有著廣泛的寄主，除黃瓜外還有辣椒、大豆等。有研究者將多粘類(lèi)芽孢桿菌進(jìn)行固體發(fā)酵制成肥料用于防治辣椒疫霉病［7］。也有研究者從基因水平上篩選出抗大豆疫霉病的基因，種植含有抗病基因的大豆品種從而預(yù)防大豆疫病的發(fā)生［8］。

【本研究切入點(diǎn)】21 世紀(jì)以來(lái)，生物防治逐漸成為熱點(diǎn)。由于生存形式獨(dú)特，植物內(nèi)生菌逐漸被專(zhuān)家們廣泛關(guān)注。通過(guò)后續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生水解酶、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、抗菌物質(zhì)等多種化合物，以增強(qiáng)植物抗病能力，促進(jìn)植物快速生長(zhǎng)［9-10］。植物內(nèi)生菌還可使植物天然定殖，且能夠在植物體內(nèi)穩(wěn)定生存下來(lái)。因此，利用植物內(nèi)生菌這種手段會(huì)使防治效果更加穩(wěn)定、持久且無(wú)污染?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究的植物內(nèi)生細(xì)菌分離篩選自黃瓜葉片，通過(guò)平板對(duì)峙法和發(fā)酵液拮抗法篩選出對(duì)掘氏疫霉菌具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定。分析此內(nèi)生細(xì)菌對(duì)掘氏疫霉菌的拮抗作用，為進(jìn)一步開(kāi)展理論研究和應(yīng)用提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜（中農(nóng)26 號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所研制）葉片于2021 年6 月25 日采自天津市武清區(qū)下朱莊。

掘氏疫霉，目前存于本實(shí)驗(yàn)室，于2021 年6 月15 日由北京理工大學(xué)生命學(xué)院馮永君先生惠贈(zèng)。

NA 培養(yǎng)基：1.5 g 牛肉膏、5.0 g 蛋白胨、7.5 g NaCl，加入去離子水定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.2～7.4，加入7.5 g 瓊脂混勻；121℃條件下蒸汽滅菌20 min。

PDA 培養(yǎng)基：100.0 g 除去表皮的馬鈴薯塊、10.0 g 葡萄糖、7.5 g 瓊脂，加去離子水至500 mL；115℃、0.1 MPa 條件下蒸汽滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離和初步鑒定 2021 年6 月27日于廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心開(kāi)始展試驗(yàn)。

取黃瓜葉片，清理表面并洗凈吸干。對(duì)進(jìn)行了初步處理的黃瓜葉片的表面完成相關(guān)消毒處理，具體操作為：（1）將濃度為75%的乙醇浸泡黃瓜葉片60 s；（2）將濃度為2.5%的次氯酸浸泡黃瓜葉片5 min；（3）將濃度為75%的乙醇沖洗黃瓜葉片30 s；（4）使用無(wú)菌水反復(fù)沖洗黃瓜葉片5 次；（5）為了檢查黃瓜葉片表面是否已徹底消毒，取最后一次洗滌水100 μL，涂布到NA 平板；（6）在超凈工作臺(tái)中取經(jīng)過(guò)處理的黃瓜葉片（對(duì)角線(xiàn)處）1 g 放入研缽，并且加入9 mL 無(wú)菌水，研磨至勻漿；（7）靜置20 min 后，設(shè)置3 個(gè)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，分別取100 μL 稀釋液（按3 個(gè)稀釋濃度梯度），涂布NA 平板后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中2 d 左右。

根據(jù)待檢菌株的鏡檢特征、革蘭氏染色反應(yīng)、菌落排列方式和菌落形態(tài)特征等進(jìn)行初步篩選，篩選出存在比較明顯差異的菌落，將篩選出的菌落采用平板劃線(xiàn)法進(jìn)行3 次純化操作，純化后，再使用甘油管進(jìn)行冷凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗內(nèi)生菌的篩選與拮抗作用測(cè)定 平板對(duì)峙法：取掘氏疫霉菌接種至PDA 平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中48 h 左右，直至菌絲生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)平板（達(dá)到生長(zhǎng)旺盛），在平板邊緣取直徑為6 mm 的菌絲塊，置于距離中央等距打有4 孔的空白PDA 平板中央，在其中的1 個(gè)孔中滴加NA 液體培養(yǎng)基100 μL 作為空白陰性對(duì)照，剩下3 孔作為試驗(yàn)處理，分別滴加100 μL 待測(cè)內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)液（1 × 108CFU/mL 濃度）；同時(shí)設(shè)置1 個(gè)中央接種菌絲塊但不打孔接種待測(cè)細(xì)菌的空白PDA 平板作為掘氏疫霉菌菌絲生長(zhǎng)距離的對(duì)照。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至掘氏疫霉菌菌絲生長(zhǎng)距離徹底滿(mǎn)過(guò)對(duì)照孔并延伸至平板邊沿，每個(gè)處理3 次重復(fù)，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率：

發(fā)酵液拮抗法：將待測(cè)菌株活化后接種至NA液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)（30℃，2.67 r/s）5 d 后，吸取適量培養(yǎng)液用過(guò)濾器（0.22 μm）過(guò)濾，在16 mL 溫?zé)岬腜DA 培養(yǎng)基中加入4 mL 濾液（同時(shí)作為陰性對(duì)照設(shè)置添加4 mL 無(wú)菌水處理）充分混合均勻后倒平板，在平板中央接種直徑為6 mm的掘氏疫霉菌菌絲塊，移入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)，計(jì)算抑菌率：

1.2.3 拮抗內(nèi)生菌的分子鑒定

在液體NA 培養(yǎng)基中接種待測(cè)拮抗細(xì)菌，置恒溫?fù)u床（30℃，2.67 r/s）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取培養(yǎng)液利用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，以待測(cè)菌株基因組DNA 為模板，采用引物（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 擴(kuò)增其16S rDNA 序列。

PCR 反應(yīng)體系：30 μL 2×PCR Buffer，引物各3 μL，9 μL DNA 模板，超凈水補(bǔ)足至60 μL；PCR擴(kuò)增程序如下：94℃ 10 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物回收后用pMD18-T載體進(jìn)行T連接，提取重組質(zhì)粒測(cè)序（蘇州金唯智生物科技有限公司）。

將所獲序列導(dǎo)入NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的BLAST 查詢(xún)系統(tǒng)進(jìn)行比對(duì)分析，用CLUSTAL_X 程序?qū)δ繕?biāo)菌株及相關(guān)菌株16S rDNA 序列進(jìn)行處理獲得ALN 文件，然后用MEGA 7 軟件對(duì)ALN 文件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行分類(lèi)分析、數(shù)據(jù)距離度量和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建（鄰域連接法Neighbor-Jioning，NJ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜葉內(nèi)生菌的分離與初步鑒定

以黃瓜葉片為原材料，進(jìn)行內(nèi)生菌分離與純化操作，根據(jù)待測(cè)菌株的鏡檢、革蘭氏染色反應(yīng)、菌落排列方式和菌落形態(tài)等差異，獲得32 株內(nèi)生細(xì)菌編號(hào)為CL1～CL3，其中革蘭氏陰性桿菌10 株、革蘭氏陽(yáng)性桿菌13 株、革蘭氏陽(yáng)性球菌9 株。

2.2 掘氏疫霉菌拮抗內(nèi)生菌的篩選

以分離得到的32 株黃瓜內(nèi)生細(xì)菌為材料，利用平板對(duì)峙法進(jìn)行相關(guān)拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)8 株對(duì)掘氏疫霉有較強(qiáng)抑制作用的拮抗菌株（表1），菌絲抑制率為10.3%～54.3%，抑菌半徑為1～7 mm；抑菌效果較好的菌株有3 株分別為CL7、CL9 和CL15，抑菌半徑及菌絲抑制率分別為：6 mm，45.2%；7 mm，54.3%；6 mm，40.2%。

表1 抗掘氏疫霉內(nèi)生拮抗菌的抑菌半徑和菌絲抑制率Table 1 Inhibition radius and mycelial inhibition rate of endophytic antagonists against Phytophthora drechsleri

圖1 展示了具有較強(qiáng)抑制作用的3 株拮抗菌株，從圖1 可以看出3 株拮抗菌均能有效抑制掘氏疫霉的生長(zhǎng)。

圖1 黃瓜內(nèi)生細(xì)菌對(duì)掘氏疫霉平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Fig.1 Results of plate confrontation experiment of endophytic bacteria against Phytophthora drechsleri in cucumber

通過(guò)發(fā)酵液拮抗法實(shí)驗(yàn)，對(duì)菌株CL7、CL9、CL15 作進(jìn)一步測(cè)定，結(jié)果表明，3 個(gè)菌株的發(fā)酵濾液均對(duì)掘氏疫霉有拮抗效果（圖2），其中CL9 菌株發(fā)酵液對(duì)掘氏疫霉菌的抑菌率達(dá)到72.2%（表2）。

圖2 CL9 菌株對(duì)掘氏疫霉菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of CL9 strain on Phytophthora drechsleri

表2 抑制作用較強(qiáng)菌株發(fā)酵液對(duì)抗掘氏疫霉的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of strong strain fermentation liquor against Phytophthora drechsleri

2.3 掘氏疫霉菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定

將抑菌效果較強(qiáng)的拮抗菌（抑菌半徑＞6 mm，菌絲抑制率＞ 40.0%）進(jìn)行16S rDNA 序列測(cè)定及同源性分析（表3），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。從表3 可以看出，CL9 和CL15 分別與Pseudomonas f lavescens和Staphylococcussp.親 緣關(guān)系最近，同源性分別達(dá)到99.72%和99.93%；CL7 與Pantoea wallisii同源性為99.58%。

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的拮抗內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of antagonistic endophytic bacteria based on 16 SrDNA sequences

表3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA 序列相似性分析Table 3 Similarity analysis of 16S rDNA sequences of antagonistic endophytic bacteria

經(jīng)分子鑒定，確定具備較強(qiáng)拮抗效果的3 株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于泛菌屬Pantoeasp.（CL7）、假單胞菌屬Pseudomonassp.（CL9）和葡萄球菌屬Staphylococcussp.（CL15）。

3 討論

黃瓜疫病發(fā)生普遍，黃瓜各個(gè)部位均可被侵染，造成幼苗猝倒、莖桿枯死、果實(shí)腐爛，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致絕產(chǎn)，對(duì)黃瓜產(chǎn)量影響很大。黃瓜疫病暴發(fā)突然，采瓜季節(jié)易造成黃瓜植株成片枯死，使黃瓜減產(chǎn)60%以上。青海、海南、江蘇等地都曾有過(guò)黃瓜疫病大面積暴發(fā)的案例。黃瓜疫病的防治方法主要以農(nóng)業(yè)防治（利用云南黑籽南瓜作砧木與黃瓜嫁接，利用太陽(yáng)能對(duì)土壤進(jìn)行消毒等）和化學(xué)防治（用72.2%霜霉威水、18.7%烯?！み吝蝓ニ龋橹鳌＿@些防治措施受地理氣候等因素影響，有多種局限性；而且化學(xué)試劑毒性強(qiáng)，在植物和土壤中停留時(shí)間長(zhǎng)，容易使霉菌產(chǎn)生抗藥性，對(duì)人類(lèi)和環(huán)境造成威脅［11-13］?，F(xiàn)有研究報(bào)道稱(chēng)，植物內(nèi)生細(xì)菌不僅可以促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，還可以增強(qiáng)宿主的抗逆性［14］。馬東麗等以曼陀羅葉片為材料分離得到的內(nèi)生細(xì)菌MY1 對(duì)谷瘟病菌等14 種植物病原真菌均有良好的抑菌效果，可以證實(shí)植物內(nèi)生細(xì)菌具有增強(qiáng)宿主抗逆性的特點(diǎn)［15］。本研究以黃瓜葉片為材料發(fā)現(xiàn)對(duì)掘氏疫霉菌有較強(qiáng)抑制作用的3 株拮抗菌株，這3 株拮抗菌株分別屬于泛菌屬Pantoeasp.、假單胞菌屬Pseudomonassp.和葡萄球菌屬Staphylococcussp.，為植物內(nèi)生菌相關(guān)研究提供材料，同時(shí)為利用植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物防治提供了有效思路。

利用植物內(nèi)生菌防治植物病害異于傳統(tǒng)方法，從植物-微生物互作、微生物之間互作、微生態(tài)等角度研究植物病原菌的防治綠色環(huán)保，具有很強(qiáng)的潛在應(yīng)用價(jià)值［16］。Gao 等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌SXKF16-1 對(duì)茄花鐮刀菌和尖葉鐮刀菌具有明顯的拮抗作用，能增加根區(qū)土壤細(xì)菌多樣性，在防治土傳病害黃芪根腐病的應(yīng)用上有良好的研究前景［17］；Wang 等研究證實(shí)丹參內(nèi)生真菌抗真菌效果顯著，對(duì)改善作物品質(zhì)和生產(chǎn)具有重要意義［18］。目前，應(yīng)用最廣泛的拮抗微生物主要有鏈霉菌、芽孢桿菌、類(lèi)芽孢桿菌及假單胞菌等［19-21］。芽孢桿菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能并應(yīng)用于多種植物病原菌的生物防治，通過(guò)分泌細(xì)胞外代謝物如抗生素、細(xì)胞壁水解酶和鐵載體等表現(xiàn)出拮抗活性［22］。而本研究篩選出的內(nèi)生細(xì)菌假單胞菌屬（Pseudomonassp.）CL9 對(duì)掘氏疫霉菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗效果，其發(fā)酵液也存在很強(qiáng)的抑菌作用，說(shuō)明該菌株也產(chǎn)生了某種抗菌物質(zhì)，為后續(xù)深入研究?jī)?nèi)生拮抗細(xì)菌的抑菌作用機(jī)制提供良好的材料。

4 結(jié)論

本研究以黃瓜葉片為材料，根據(jù)菌株的特征差異分離得到32 株內(nèi)生細(xì)菌，隨后利用平板對(duì)峙法及發(fā)酵液拮抗法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，最終得到3 株掘氏疫霉拮抗菌株。通過(guò)分子鑒定確定其分別屬于泛菌屬Pantoeasp.（CL7,菌絲抑制率45.2%）、假單胞菌屬Pseudomonassp.（CL9，菌絲抑制率54.3%）和葡萄球菌屬Staphylococcussp.（CL15，菌絲抑制率40.2%）。