楊素華，曾憲彪，鄧聿胤，陸順忠，黎貴卿，蘇驪華，黨中廣

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院/廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022）

【研究意義】精油一般是指采用水蒸氣蒸餾從天然植物的枝、葉、根、干、果等部位提取出來的芳香揮發(fā)油，具有抗菌活性，可以抑制細菌或者真菌的生長，已被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)療保健、化妝品及農(nóng)藥研發(fā)等方面［1-3］。純露是指水蒸氣蒸餾提取芳香植物精油過程中，水蒸氣冷凝下來的的副產(chǎn)品，含有少量的精油成分及活性物質(zhì)，具有良好的抗菌、驅(qū)蟲、保健作用［4］。探討芳樟醇型、檸檬醛型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露的揮發(fā)性成分、物理性質(zhì)和抑菌效果，為樟樹葉純露作為天然防腐劑和消毒產(chǎn)品等提供參考?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發(fā)現(xiàn)蒲公英、生姜、薄荷、艾葉、內(nèi)蒙古薰衣草、香葉天竺葵等植物純露具有抑菌性和抗氧化性［5-13］。王斌等［14］研究發(fā)現(xiàn)迷迭香純露、薄荷純露和玫瑰純露對鮮切芋頭具有很好的保鮮作用。張洪廣等［15］研究發(fā)現(xiàn)玫瑰純露具有保濕、美白、抗氧化等功效，可以開發(fā)成化妝水、消毒劑、果蔬保鮮劑等。樟樹是主要的天然芳香植物樹種，按樟樹葉精油的主要成分，可將樟樹葉精油分為芳樟型、油樟型、龍腦型、檸檬醛型等不同化學類型［16-21］。目前對樟樹的研究，主要集中在精油的抗氧化性和抑菌性。李嘉欣等［22］研究發(fā)現(xiàn)異樟、腦樟、油樟和芳樟葉精油均具有一定的抗氧化能力。張平等［23］采用二倍釋法測定油樟油對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果時，發(fā)現(xiàn)油樟油中具有抑菌活性的主要物質(zhì)為松油烯-4-醇和1，8-桉葉油素。王芳等［24］采用二氧化碳膨脹乙醇從香樟葉中提取精油，發(fā)現(xiàn)精油對真菌有較高的抑制活性。對樟樹葉純露的研究甚少。吳芳等［25］以不同季節(jié)宜賓油樟葉純露為研究對象，通過抑菌圈、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度，研究不同季節(jié)純露對大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)油樟葉純露中的主要組分為1，8-桉葉油素、α-松油醇和松油烯-4-醇，不同季節(jié)純露對4 種供試微生物均有明顯的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好?？梢娂兟蹲鳛榫蜕a(chǎn)副產(chǎn)物，具有一定的開發(fā)潛力?！颈狙芯壳腥朦c】目前對樟樹的研究主要集中在精油的抗氧化性和抑菌性，對樟樹葉純露的研究甚少。本研究通過采用水蒸氣蒸餾法提取芳樟醇型、檸檬醛型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露，探討純露的揮發(fā)性成分、物理性質(zhì)和抑菌效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露為試驗材料，研究其主要成分、物理性質(zhì)及其對幾種常見食源性致病微生物的抗菌效果，以期為純露的開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要儀器：恒溫細菌培養(yǎng)箱（HYQX-II）、恒溫霉菌培養(yǎng)箱（MJ-300），上海躍進醫(yī)療器械有限公司；高壓滅菌鍋（SX-500），TOMY公司；高溫干燥烤箱（BPG-9050AH），上海一恒科學儀器有限公司；恒溫（30~38℃）水浴鍋（HH-6），常州國華儀器有限公司；電熱套（98-I-B），天津市泰斯特儀器有限公司；氣相色譜儀（Agilent 7890A）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890B-5977A），安捷倫科技有限公司；0.2 μm薄膜篩濾過除菌器（MILLEX GP）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE－52AA），上海亞榮生化儀器廠。

不同化學類型的新鮮樟樹葉采自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院海拔為85 ～255 m 的種質(zhì)資源庫，每種化學型選取3 株，于2021 年5 月在同一株樟樹的東、南、西、北、中等不同部位采集鮮葉約1 500 g。樣品用塑料袋密封，置于4℃冰箱低溫保存，待測。

培養(yǎng)基：胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基（批號201010）、胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（批號190815）、沙氏液體培養(yǎng)基（批號190326）、沙氏瓊脂培養(yǎng)基（批號200927），購自北京陸橋技術(shù)有限公司。

對照品：陽性對照品包括抗細菌的復(fù)方新諾明（400 mg 磺胺甲惡唑、80 mg 甲氧芐胺嘧啶，上海新亞藥業(yè)閔行有限公司），抗真菌的洗必泰（廣州邦樂達生物科技有限公司）；陰性對照品為生理鹽水（0.9%，上海方太醫(yī)療器械有限公司）；固體溶劑對照品：二甲亞砜、標準緩沖液（廣東光華科技股份有限公司）。

供試菌株：金黃色葡萄球菌（Staphyloccus aureus）〔CMCC（B）26003〕，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕，大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10104〕，白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（B）98001〕，以上標準菌株均由廣東環(huán)凱科技有限公司提供，供試菌株由凍干質(zhì)控菌種轉(zhuǎn)種所生，是本種源的5 代內(nèi)后裔。

1.2 試驗方法

1.2.1 純露的提取 將采集到的新鮮葉子剪至1~2 cm，稱取1 000 g 葉子和去離子水1 000 mL置于揮發(fā)油裝置中，加沸石進行水蒸氣蒸餾3.5 h，收集揮發(fā)油測定器中的下層液體即得飽和純露。再取500 mL 飽和純露和50 mL 石油醚混合搖勻，將混合液用分液漏斗分離，分離后將上層油狀有機液放入250 mL 錐形瓶，下層水溶液置于分液漏斗，再加入50 mL 石油醚后再分離，反復(fù)操作2 次。將3 次收集的油狀有機液體加入25 g 硫酸鈉，脫水，取上層油狀液體于200 mL 雞心瓶，在真空為-0.06 MPa，溫度為46~48℃、轉(zhuǎn)速為60 r/min的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸1 min，即得到純露揮發(fā)油。

1.2.2 純露的主要成分分析 升溫程序：色譜柱HP-INNOWAX（30 m×0.32 mm，0.5 μm）。初始溫度70℃，以1.5 ℃/min 升至100℃，然后以3℃/min升至135℃，保持30 min，然后再以5℃/min 升至200℃，最后以10℃/min 升至250℃，保持10 min。進樣量0.2 μL，進樣口溫度250℃，分流比50∶1，流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式E1，電離能量70 eV，離子源溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍30~450 amu。

1.2.3 純露的物理性質(zhì)測定 pH 值：將pH 計的電極、蒸餾水和標準緩沖液調(diào)至25℃，用蒸餾水沖洗電極，用標準緩沖液校正pH 計。稱取純露100 mL 加入燒杯，將pH 計電極插入試樣，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄讀數(shù)。平均測定3 次。

相對密度：采用密度瓶法測定。

耐熱：在40℃下保持24 h，恢復(fù)至室溫，觀察有無分層現(xiàn)象。

耐寒：在-8℃下保持24 h，恢復(fù)至室溫，觀察有無分層現(xiàn)象。

離心考驗：在轉(zhuǎn)速2 000 r/min 下旋轉(zhuǎn)30 min，觀察有無分層現(xiàn)象。

1.2.4 純露的抑菌活性檢測 培養(yǎng)基制備：取胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基30 g、胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基40 g、沙氏液體培養(yǎng)基50 g、沙氏瓊脂培養(yǎng)基70 g，分別用蒸餾水配成1 L 溶液，高壓滅菌，密封存放，備用。

菌懸液制備：取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠膿假單孢菌、枯草芽孢桿菌凍干質(zhì)控菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于35℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)入無菌生理鹽水，稀釋，倒入胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，置于35℃培養(yǎng)24 h；取白色念珠菌凍干質(zhì)控菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏液體培養(yǎng)基，置于25℃培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)入無菌生理鹽水，稀釋，倒入沙氏瓊脂培養(yǎng)基，置于25℃培養(yǎng)48 h；試驗菌懸液細菌密度約為50~100 CFU/mL。

抑菌性試驗：分別采用試管二倍稀釋法和紙片法。

試管法：抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌試驗：試驗在超凈工作臺上進行，取待檢純露、陽性（復(fù)方新諾明）試驗藥液、陰性試驗藥液滅菌玻璃試管各5 支，每管加胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基2 mL，待檢純露、陽性（復(fù)方新諾明）試驗藥液、陰性試驗藥液2 mL加至第l 管，混勻后取2 mL 加至第2 管，同法依次對倍稀釋至第5 管，各管藥液稀釋度分別為2、4、8、16、32 倍。第5 管混勻后棄去2 mL。然后每管加入細菌密度約為50 ～100 CFU/mL 的試驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌）懸液0.1 mL。另取2 支試管做陽性、陰性對照。置35℃培養(yǎng)24 h。該培養(yǎng)管的待檢藥物濃度即為待檢藥物的最低抑菌濃度 （MIC）。取無菌生長或菌生長受抑制試管內(nèi)的培養(yǎng)物0.1 mL注入平皿，加注不超過45℃的胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15~20 mL，待冷后倒置于35℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落生長，取瓊脂培養(yǎng)基生長菌落不超過5 個者，與其相對應(yīng)的培養(yǎng)管藥物濃度，即為該待檢藥物的最低殺菌濃度（MBC）［28］。重復(fù)5 次。

抗白色念珠菌試驗：再取待檢純露、陽性（復(fù)方新諾明）試驗藥液、陰性試驗藥液滅菌玻璃試管滅菌玻璃試管各5 支，每管沙氏液體培養(yǎng)基2 mL。取已配制和除菌處理過的待檢純露、陽性（洗必泰）試驗藥液、陰性試驗藥液）2 mL 加至第1 管，混勻后取2 mL 加至第2 管，同法依次對倍稀釋至第5 管。第5 管混勻后棄去2 mL。然后每管加入細菌密度約為50~100 CFU/mL 的試驗菌（白色念珠菌）懸液0.1 mL。另取2 支試管做陽性、陰性對照。置25℃培養(yǎng)48 h。每藥作雙樣品測定，培養(yǎng)后觀察有無菌生長，記錄MIC 和MBC。每種藥對同一個細菌，同樣過程重復(fù)5 次。

紙片法：取厚濾紙，用直徑6 mm 沖子打出圓形紙片若干，高壓滅菌。每一紙片吸取揮發(fā)油、純露、復(fù)方新諾明、洗必泰、生理鹽水、二甲亞砜浸濕，備用。分別將藥帖片貼片帖貼于涂有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平皿內(nèi)培養(yǎng)24 h；分別將藥帖片貼片帖貼于涂有白色念珠菌的沙氏瓊脂培養(yǎng)基平皿內(nèi)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后測量帖片周圍抑菌圈直徑。每個處理3 次重復(fù)。抑菌圈實驗結(jié)果判定參照以下標準：抑菌圈直徑>20 mm 為極度敏感，15~20 mm 為高度敏感，10~15 mm 時為中度敏感，7~9 mm 時為低度敏感，<7 mm為不敏感［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化學類型樟樹葉純露的成分及其相對質(zhì)量

將所測成分的色譜峰與NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行比對檢索，并按相對豐度、質(zhì)荷比、匹配度等進行核對比較，對各色譜峰所對應(yīng)的物質(zhì)加以確認，并采用色譜峰面積歸一化法，得出不同化學類型樟樹葉純露平均相對質(zhì)量分數(shù)>1%的主成分。由表1可見，芳樟醇型純露平均相對質(zhì)量>1%的化合物有6種，分別為γ-松油烯、芳樟醇、樟腦、4-松油醇、α-松油醇、香芹酚，純露的主要成分為芳樟醇，平均相對質(zhì)量為74.03%；檸檬醛型純露平均相對質(zhì)量>1%的化合物有10種，分別為芳樟醇、龍腦、4-松油醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醛、香葉醇、香葉醛、葎草烯、石竹烯氧化物，純露的主要成分為橙花醛和香葉醛，平均相對質(zhì)量分別為14.23%、29.26%；油樟型純露平均相對質(zhì)量>1%的化合物有6種，分別為檸檬烯、1，8-桉葉油素、芳樟醇、龍腦、4-松油醇、α-松油醇，純露的主要成分為1，8-桉葉油素，平均相對質(zhì)量為50.36%；龍腦型純露平均相對質(zhì)量>1%的化合物有5種，分別為檸檬烯、樟腦、龍腦、香芹酚、石竹烯，純露的主要成分為龍腦，平均相對質(zhì)量為82.27%。檸檬醛型純露平均相對質(zhì)量>1%的化合物數(shù)量最多。

表1 不同化學類型樟樹葉純露的成分及其相對質(zhì)量Table 1 Components and relative mass of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves

2.2 不同化學類型樟樹葉純露的物理性質(zhì)

由表2 可見，檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露均為無色澄清液體，均具有各自的特征氣味，pH 值均為弱酸性，相對密度均>1.0000。不同化學類型純露的pH 值和相對密度相差不大，其中龍腦型純露的pH 值和相對密度稍高于其他類型純露。從耐熱、耐寒、離心考驗等指標來看，不同化學類型純露的性質(zhì)比較穩(wěn)定，不會在溫度反復(fù)變化或者轉(zhuǎn)動的情況下發(fā)生改變或者加速老化。

表2 不同化學類型樟樹葉純露的物理性質(zhì) Table 2 Physical properties of hydrosol from different types of Cinnamomum camphora leaves

2.3 不同化學類型樟樹葉純露的抑菌活性

檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露的抑菌圈直徑見表3。參照抑菌圈實驗結(jié)果判定標準進行評價后發(fā)現(xiàn)，在合適溫度下，各菌株經(jīng)合適時間培養(yǎng)，菌落或菌苔生長良好，菌落特征符合菌株菌落特征。陽性藥帖片周圍有明顯抑菌圈，陰性藥帖片周圍無抑菌圈。不同化學類型純露對以白色念珠菌為代表的真菌均有抑制作用，油樟型純露還對枯草芽孢桿菌有抑制作用，其他化學類型對細菌沒有抑制作用。其中檸檬醛型、芳樟醇型純露對白色念珠菌的抑菌圈直徑均>20 mm，屬于極度敏感，抑菌圈直徑均為25 mm，抗菌效果很好。油樟型純露對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑菌圈直徑都為6 mm，屬于不敏感。龍腦型純露對白色念珠菌的抑菌圈直徑為10 mm，屬于中度敏感。

表3 不同化學類型樟樹葉純露的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of inhibition zone of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves (mm)

檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露的MIC 和MBC 見表4。在合適溫度下，各菌株經(jīng)合適時間培養(yǎng)，有菌無藥對照管混濁有菌生長，有藥無菌對照管澄明無菌生長，陽性藥管呈澄清透明，陰性藥管有紊絮狀混濁或豆腐渣樣凝塊。不同化學類型純露中，芳樟醇型純露的抑菌效果最好，對所有試驗菌的MIC 為250 μL/mL。其次抑菌效果較好的為油樟型和檸檬醛型樟樹葉純露，其對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC均為250 μL/mL，對大腸埃希菌、銅綠膿假單孢菌、枯草芽孢桿菌的MIC 均為500 μL/mL；油樟型樟樹葉純露的殺菌效果最好，其對供試細菌和真菌的MBC 為250 μL/mL。其次是芳樟醇型和龍腦型樟樹葉純露，其對枯草芽孢桿菌的MBC 為250 μL/mL，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠膿假單孢菌、白色念珠菌的MBC 均為500 μL/mL。

表4 不同化學類型樟樹葉純露的MIC 和MBCTable 4 MIC and MBC of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves

3 討論

研究表明，樟樹葉揮發(fā)油主要含有1，8-桉葉油素、芳樟醇、松油醇、樟腦、龍腦和檸檬醛等［17-20,27］化學成分，具有一定的殺菌、消毒效果，是食品、香精香料和醫(yī)藥等行業(yè)的重要原料［21］。吳克剛等［28］研究發(fā)現(xiàn)芳樟醇具有較強的氣相抗菌活性。王新偉等［29］研究發(fā)現(xiàn)檸檬醛對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。桉葉油素可用于配制牙膏、化妝品、口香糖、驅(qū)風膏［30］等。馬英姿等［31］研究發(fā)現(xiàn)樟樹精油具有較好的抑菌效果，冰片（富含龍腦）具有很強的抗菌作用。而樟樹葉純露是提取精油后的副產(chǎn)物，也具有少量精油成分及活性物質(zhì)，且產(chǎn)量大，易獲得，如今后可以在天然防腐保鮮、消殺產(chǎn)品等方面應(yīng)用，將具有一定的潛在開發(fā)利用價值。

試管法抗菌試驗藥物直接接觸菌株，在有效濃度下，藥物活性成分即可以有足夠量進入菌體，抑制或殺滅菌，紙片法抗菌試驗有賴于藥物擴散并在紙片周圍形成有效藥物濃度，才能形成明顯抑菌圈，某些脂溶性成份在水溶性瓊脂培養(yǎng)基中的擴散性不是很好，所以會有樣品在試管法試驗中表現(xiàn)為有抑菌活性而在紙片法試驗中抑菌圈不明顯，此可以解釋油樟醛型純露在試管法具有很好的抑菌和殺菌作用，而在紙片法試驗中無明顯的抑菌活性，可能是純露的抗菌成分為脂溶性物質(zhì)。

目前，對芳香植物純露的應(yīng)用，有少數(shù)學者研究。高雅博［32］通過原料篩選、配方設(shè)計、性能評價及配方優(yōu)化的研究確定了洗手液的基礎(chǔ)配方及工藝流程，研發(fā)了一款茶樹純露為特征成分的抑菌洗手液。于曉雪等［33］在蛋雞飲用水中添加茶樹純露，對蛋黃顏色、哈氏單位、蛋殼顏色等雞蛋品質(zhì)指標進行檢測和分析，研究添加茶樹純露對雞蛋品質(zhì)的影響，為茶樹純露用于改善雞蛋品質(zhì)提供了參考。朱云娜等［34］在探討香茅純露對蔬菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響時，利用香茅純露對番茄、菜心種子萌發(fā)和幼苗生長均存在“低促高抑”效應(yīng)，將香茅純露應(yīng)用在蔬菜生產(chǎn)中。

本研究僅討論了樟樹葉純露的揮發(fā)性成分、理化性質(zhì)和抑菌效果，研究仍不夠深入和全面，如果要將樟樹純露產(chǎn)品化，今后還要進一步對純露的抑菌機理進行研究和探討，以及開展對皮膚黏膜刺激性和人體毒性相關(guān)的研究。

4 結(jié)論

芳樟醇型樟樹葉純露的主要揮發(fā)性成分為芳樟醇，相對質(zhì)量為74.03%；檸檬醛型樟樹葉純露的主要揮發(fā)性成分為橙花醛和香葉醛，相對質(zhì)量分別為14.23%、29.26%；油樟型樟樹葉純露的主要揮發(fā)性成分為1,8-桉葉油素，相對質(zhì)量為50.36%；龍腦型樟樹葉純露的主要揮發(fā)性成分為龍腦，相對質(zhì)量為82.27%；芳樟醇型樟葉純露的抑菌效果最好，其對供試細菌和真菌的MIC 均為250 μL/mL，其次抑菌效果較好的為油樟型和檸檬醛型樟樹葉純露；油樟型樟樹葉純露的殺菌效果最好，其對供試細菌和真菌的MBC 為250 μL/mL，其次是龍腦型和芳樟醇型樟樹葉純露。

各種純露具有各自的特征氣味，都是弱酸性的，相對密度均>1.0000。不同化學類型純露的pH值和相對密度相差不大，其中龍腦型純露的pH值和相對密度稍高于其他類型純露，各純露的性質(zhì)穩(wěn)定。