鄧?？斡晖?，馮婷茵，孫蘇里

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006）

甲基炔諾酮（Norgestrel，NGT）是一種合成的類固醇孕酮，與乙炔雌二醇聯(lián)合用于口服避孕。諾孕酮是由右旋諾孕酮和左旋諾孕酮這2 種立體異構體組成的外消旋混合物。然而，只有左旋對映體（左炔諾孕酮）具有生物活性。作為避孕藥中的活性成分，左炔諾孕酮對三棘刺魚（Gasterosteus aeuleatus）有強烈的雄激素效應，同時也發(fā)現(xiàn)其對雌性黑頭呆魚（Pimephales promelas）有雄性化作用[1-2]。此外，在畜牧業(yè)中，甲基炔諾酮也經(jīng)常用于控制牲畜的繁殖。由于甲基炔諾酮的廣泛應用，加上污水處理廠過濾不徹底，導致不同水體中存在一定濃度的甲基炔諾酮。例如，曾在地表水體和污水處理廠廢水中檢測到22 和11 ng/L 的甲基炔諾酮。在畜牧產(chǎn)業(yè)排放的廢水中，廣西某豬場和某奶牛廠就曾檢測到濃度高達6 460～10 800 ng/L 的甲基炔諾酮[3-6]。這些大量存在于水體環(huán)境中的甲基炔諾酮會嚴重影響斑馬魚的生長發(fā)育。

斑馬魚是一種生活在熱帶的小型淡水魚，具有適應性強、對水質要求低、在實驗室環(huán)境下易于飼養(yǎng)、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎易收集等特點，是環(huán)境毒理學試驗的理想模型[7]。此外，斑馬魚的遺傳背景明確，與人類的基因組具有高度同源性[8-9]。因此，筆者以斑馬魚作為研究模型，通過比較不同濃度NGT暴露下斑馬魚胚胎的轉錄組表達水平，尋找NGT 影響下表達發(fā)生明顯差異的基因，從而揭示水體環(huán)境中不同濃度NGT 對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將斑馬魚在實驗室條件下穩(wěn)定飼養(yǎng)3 個月（控制飼養(yǎng)水體環(huán)境的硬度、pH 值、溶解氧含量、溫度、光周期等參數(shù)）。穩(wěn)定后挑選成熟健康的斑馬魚進行交配，控制溫度26℃，光暗比為12 h ∶12 h，挑選新產(chǎn)出的健康斑馬魚胚胎用于暴露試驗。

主要試驗試劑有甲基炔諾酮（純度99%）、二甲亞砜（DSMO，純度99%）、RNA keeper、TRIzol 試劑、曝氣24 h 自來水等，試驗所用試劑均為分析純。主要試驗儀器有燒杯、移液槍、塑料吸管、Illumina Hiseq 2000 測序儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 NGT 暴露試驗 將挑選好的斑馬魚胚胎分別暴露在含有0、5、50 ng/L NGT 的水體環(huán)境中，暴露時間為96 h，每個濃度設置3 個生物學重復平行組。在暴露試驗過程中，每12 h 更新一次暴露環(huán)境，以保持整個暴露過程中條件保持穩(wěn)定，空白對照組使用曝氣24 h 的自來水。毒性測試要求試驗過程中水的pH 值變動范圍在±0.2，溫度變化范圍在±1℃，試驗結束后溶解氧的濃度不低于2 mg/L。

12.2 RNA 測序 使用TRIzol 等試劑提取斑馬魚胚胎中的mRNA，將其保存在RNA keeper 中。使用斑馬魚胚胎中提取到的mRNA 構建cDNA 文庫，并在Illumina Hiseq 2000 測序儀上進行測序。

1.2.3 基因表達差異分析 得到RNA 測序表達譜后，采用DESeq2 軟件[10]分析不同濃度NGT 暴露下有顯著表達差異的基因。顯著差異的閾值設置為|log2FoldChange| ≥ 1 和P＜0.05。

1.2.4 Gene ontology（GO）富集分析 采用clusterProfiler軟件[11]對不同濃度NGT 暴露下有顯著表達差異的基因進行GO 富集分析。設置P＜0.05 為顯著富集的GO 選項。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NGT 暴露下斑馬魚早期胚胎基因表達差異分析

試驗共檢測到了32 520 個基因，比對5、50 ng/L NGT 處理組與空白對照組的基因表達，得到5 和50 ng/L NGT 暴露下斑馬魚差異表達的基因，如表1 所示。5 ng/L NGT 處理組中共有24 個基因的表達水平出現(xiàn)顯著差異，其中22 個基因的表達量相比對照組上升，2 個基因的表達量相比對照組下降。以log2FoldChange 值作為差異程度指標，表達上調(diào)幅度最大的基因為srsf3a，其log2FoldChange 值為3.66（P=1.71e-02）；表達下調(diào)幅度最大的基因為egr4，log2FoldChange 值 為-1.51（P= 7.14e-07）。 在50 ng/L NGT 處理組中，發(fā)生顯著差異表達的基因數(shù)僅有6 個，分別為fkbp5、cyldb、si:ch211-14i3.2、si:dkey-202l22.6、dhrs13a.2和CU137681.1。5 和50 ng/L NGT 處理組的差異表達基因具體分布情況如圖1 和圖2 所示，可以看出較低濃度NGT 暴露下斑馬魚胚胎的基因表達比較高濃度的NGT 暴露環(huán)境下有更大的差異。

圖1 5 ng/L NGT 處理組斑馬魚差異表達的基因

圖2 50 ng/L NGT 處理組斑馬魚差異表達的基因

表1 5 和50 ng/L NGT 暴露組顯著差異基因

2.2 差異基因富集分析

找到5 與50 ng/L NGT 處理組斑馬魚表達的差異基因之后，通過GO 功能富集，對這些差異基因對應的分子功能以及它們影響的生理過程進行注釋和分析，結果如表2 所示。5 ng/L NGT 暴露處理組中，差異表達的基因主要富集在與“基因表達的晝夜節(jié)律調(diào)控”“細胞核受體活性”“配體激活的轉錄因子活性”“類固醇激素受體活性”“細胞成熟”等功能相關的GO選項中。其中，nr1d2a、nr1d1、per1a基因與晝夜節(jié)律調(diào)控有關；nr1d2a、nr1d1、nr4a1基因與細胞核受體活性、類固醇激素受體活性有關；klf9、klf3基因則與細胞成熟，例如紅細胞的發(fā)育和成熟有關。而50 ng/L NGT 暴露處理組中，差異表達的基因主要富集在與“視網(wǎng)膜代謝過程”“藥物結合”“細胞醛代謝過程[酒精脫氫酶（NADP+）活性、醛酮還原酶（NADP）活性]”“烯化合物代謝過程”“視黃酸類代謝過程”等功能相關的GO 選項中。其中，dhrs13a.2基因主要影響視網(wǎng)膜代謝、細胞中的醛代謝（包括NADP+活性和NADP 活性）和視黃酸類代謝等生理功能；而fkbp5基因主要與藥物結合、蛋白質肽基-脯氨酰異構化、分子伴侶介導的蛋白質折疊、肽基-輔氨酸修飾有關。

表2 5 和50 ng/L NGT 暴露組差異基因富集結果

3 結論與討論

將斑馬魚胚胎暴露在0～50 ng/L 的NGT 下，使用RNA 測序的方法，對不同濃度NGT 暴露下的斑馬魚胚胎的基因表達情況進行比較分析，尋找不同濃度NGT 影響下產(chǎn)生表達差異的基因，并通過差異基因富集分析對這些差異表達的基因進行功能注釋，找到這些差異基因的功能和它們影響的代謝過程。結果表明，較低濃度NGT（5 ng/L）暴露下的斑馬魚胚胎，相比較高濃度NGT（50 ng/L）暴露下的斑馬魚胚胎，在基因表達層面表現(xiàn)出更強的差異性。Kumar 等[12]研究表明，左炔諾酮在濃度為0.8～1.0 ng/L 時能夠降低魚類的產(chǎn)卵效率。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)其他人工合成孕激素類物質在低濃度下也會導致魚類的內(nèi)分泌紊亂，阻礙其繁殖[13-15]。結合該研究中差異表達分析結果可知，以甲基炔諾酮為代表的激素類藥物在低濃度下會對斑馬魚胚胎的生長發(fā)育產(chǎn)生更大的影響；而且，低濃度NGT 處理主要影響斑馬魚晝夜節(jié)律調(diào)控各類受體和轉錄因子的活性以及細胞的發(fā)育和成熟，高濃度NGT 處理主要影響斑馬魚的視網(wǎng)膜代謝、細胞醛代謝、烯化合物代謝以及視黃酸類代謝等新陳代謝過程。該研究結果在轉錄和基因表達層面為環(huán)境激素作用下斑馬魚早期胚胎發(fā)育的研究提供支持。今后的斑馬魚胚胎發(fā)育環(huán)境毒理研究可以在該研究基礎上進行更深入地探索。