郭建軍，曾 靜，袁 林，熊大維

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096）

傳統(tǒng)農(nóng)藥和化肥的過(guò)量使用導(dǎo)致很多植物病蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，這不僅降低了藥效和肥效，而且可能誘導(dǎo)害蟲(chóng)產(chǎn)生有毒物質(zhì)從而加大土壤有害物的殘留[1]，嚴(yán)重的甚至可能危及人類的生命安全。因此，高效、安全的生防微生物制劑越來(lái)越受到植保工作者的青睞。多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢桿菌科（Bacillaceae）類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如拮抗蛋白[2]、酶[3]、多肽抗生素[4]、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[5]及絮凝劑[6]等。該類細(xì)菌在植物葉際或根際定殖，可有效預(yù)防各種植物真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng)等病害的發(fā)生，并且能促進(jìn)植物生長(zhǎng)[7]，同時(shí)對(duì)人或動(dòng)植物沒(méi)有明顯致病性。因此，該類細(xì)菌不但可以作為生物農(nóng)藥防治植物細(xì)菌性和真菌性土傳病害[4]，還可以作為微生物肥料用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量[5]。目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種。由多粘類芽孢桿菌等制備的生防微生物制劑以其環(huán)境友好性和對(duì)土傳病害的防治安全性[8]，在農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域具備廣闊的應(yīng)用前景。

多粘類芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，且可形成抗逆性的芽孢，芽孢是多粘類芽孢桿菌在惡劣環(huán)境中產(chǎn)生的休眠體，因其含水量極低，能經(jīng)受住高溫、紫外線、電離輻射以及化學(xué)物質(zhì)滅殺等多種不良環(huán)境，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏[9]，是一種理想的生防微生物。目前，芽孢制劑主要有2 種形式，液體制劑和固體制劑。液體制劑存在運(yùn)輸成本高、貯藏時(shí)間短、活菌數(shù)低等問(wèn)題，而固體制劑在制備過(guò)程中存活率很低，導(dǎo)致田間防效不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響生防微生物制劑的推廣和應(yīng)用[10]。制劑中有效活菌數(shù)含量和貨架周期是影響制劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素[11]?，F(xiàn)有的微生物菌劑產(chǎn)品普遍存在活菌含量低、效價(jià)不高等問(wèn)題[9]，芽孢含量決定了微生物菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量，提高芽孢產(chǎn)量是工業(yè)生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)之一。因此，發(fā)酵液中芽孢含量成為評(píng)價(jià)芽孢桿菌發(fā)酵效果的重要指標(biāo)[12]。從不同生境中篩選分離的芽孢桿菌菌株對(duì)發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)條件的要求也不同[13]，學(xué)者們常通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析等方法優(yōu)化芽孢桿菌的發(fā)酵工藝，以提高芽孢產(chǎn)量[14-15]。該研究以多粘類芽孢桿菌LY1 為研究對(duì)象，以芽孢含量為考察指標(biāo)，擬通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)LY1 菌株培養(yǎng)基配方中的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行篩選，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在有效提高多粘類芽孢桿菌的芽孢數(shù)，增加產(chǎn)品活性，降低生產(chǎn)成本，為高質(zhì)量生防菌劑的開(kāi)發(fā)以及該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）LY1 分離自臍橙根際土壤，保藏于江西省生物化工工程技術(shù)研究中心微生物制劑團(tuán)隊(duì)。

1.1.2 培養(yǎng)基（1）基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：采用改良的YPD 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基，配方為葡萄糖20 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母膏 5 g/L、氯化鈉 5 g/L；（2）計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：固體YPD 培養(yǎng)基，即在上述改良的YPD 培養(yǎng)基中添加15 g/L 的瓊脂粉；（3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH值自然，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與活菌計(jì)數(shù)將保存于-80℃的LY1菌種在固體YPD 培養(yǎng)基平板上劃線，28℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落轉(zhuǎn)接種于YPD 培養(yǎng)基，28℃、160 r/min搖床培養(yǎng)20 h，得到種子液；按2%（V/V，下同）接種量接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中至30%芽孢脫落分離。采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌總數(shù)；芽孢計(jì)數(shù)時(shí)，先將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在85℃水浴15 min，以除掉菌液中的營(yíng)養(yǎng)體，稀釋后采用平板計(jì)數(shù)；芽孢率（%）=芽孢數(shù)/活菌數(shù)×100。

1.2.2 單因素試驗(yàn)將活化的多粘類芽孢桿菌LY1按2%的接種量接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為40%（100 mL/250 mL），在30℃、150 r/min 條件下，依次考察培養(yǎng)溫度（25、28、32、35、37℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、初始pH 值（5、6、7、8、9）、裝液量（10%、20%、30%、40%、50%）、搖床轉(zhuǎn)速（100、150、200、250、300 r/min）對(duì)多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢的影響，采用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定多粘類芽孢桿菌的活菌數(shù)。在培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上以芽孢含量為指標(biāo)，通過(guò)改變碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽種類篩選最佳培養(yǎng)基。選擇6 種碳源（葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麥芽糊精、玉米粉、淀粉）、6 種氮源（酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、黃豆粉、硫酸銨、尿素）、7 種無(wú)機(jī)鹽（硝酸鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、硫酸錳、碳酸鈣），分別替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的同類組分，根據(jù)菌株LY1 發(fā)酵液中芽孢含量考察各組分對(duì)多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢的影響。

1.2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝基于單因素篩選的碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽的試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面分析軟件，以培養(yǎng)后發(fā)酵液中芽孢數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行條件優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)培養(yǎng)工藝，并對(duì)配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。（1）Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)?；趩我蛩睾Y選的碳源、氮源以及培養(yǎng)條件的試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)PB 試驗(yàn)進(jìn)行下一步優(yōu)化。選擇9 個(gè)因素：A，糖蜜10～15 g/L；B，黃豆粉10～15 g/L；C，磷酸二氫鉀 5～7 g/L；D，硫酸錳 1～2 g/L；E，培養(yǎng)溫度32～35℃；F，接種量4%～6%；G，初始pH 值7～8；H，裝液量30%～40%；J，轉(zhuǎn)速200～250 r/min；從中篩選關(guān)鍵因子。試驗(yàn)設(shè)計(jì)1 個(gè)冗余變量，每個(gè)因素取2 個(gè)水平，即范圍區(qū)間最大值為高水平“1”和范圍區(qū)間中最小值為低水平“-1”，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，考察試驗(yàn)因素的影響主次。（2）最低添加量試驗(yàn)?？紤]到后期投入生產(chǎn)的成本效益最大化，挑選出影響不顯著的因素，研究其最低添加量。（3）最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)。從PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)中挑選出顯著性因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，根據(jù)因素正負(fù)效應(yīng)的大小設(shè)定變化步長(zhǎng)與方向，以進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)區(qū)域。（4）中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)。非關(guān)鍵因子以PB 試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，關(guān)鍵因子以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，運(yùn)用Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了3 因素5 水平共20 個(gè)試驗(yàn)處理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，按試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并擬合多元回歸方程，預(yù)測(cè)發(fā)酵芽孢數(shù)最大值所對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵因子范圍。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和繪圖；PB 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合試驗(yàn)均運(yùn)用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌LY1 培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1 可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌體活菌數(shù)和芽孢數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在培養(yǎng)溫度為32℃時(shí)活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達(dá)最大值；當(dāng)接種量逐漸增加時(shí)，活菌數(shù)并無(wú)明顯變化，但芽孢轉(zhuǎn)化率呈先升高后降低的趨勢(shì)，在接種量為4%時(shí)芽孢數(shù)最多；隨著初始pH值的升高，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH 值為8.0 時(shí)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達(dá)最大值；裝液量為20%時(shí)菌體生長(zhǎng)最好，當(dāng)裝液量超過(guò)20%時(shí)，活菌數(shù)顯著降低，但芽孢數(shù)卻顯著增加，在裝液量為40%時(shí)，芽孢數(shù)最多，表明40%的裝液量有利于芽孢的形成；隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株LY1 的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率均逐漸升高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速超過(guò)250 r/min 時(shí)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均呈下降趨勢(shì)，可能是轉(zhuǎn)速較高時(shí)菌體發(fā)生了細(xì)胞自溶現(xiàn)象。因此，選取培養(yǎng)溫度32℃、接種量4%、初始pH 值8.0、裝液量30%（75 mL/250 mL）、搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min 作為菌株LY1 后續(xù)試驗(yàn)的液體發(fā)酵條件。

圖1 不同培養(yǎng)條件下菌株LY1 發(fā)酵液中的活菌數(shù)和芽孢數(shù)

2.2 多粘類芽孢桿菌LY1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2 可知，菌株LY1 利用有機(jī)緩效碳源（糖蜜或玉米粉）發(fā)酵后芽孢率均顯著的高于速效碳源（蔗糖或葡萄糖）（P＜0.01），以糖蜜為碳源時(shí)芽孢數(shù)最多；添加無(wú)機(jī)氮源的培養(yǎng)基中活菌數(shù)和芽孢數(shù)顯著低于添加有機(jī)氮源的培養(yǎng)基，以黃豆粉為氮源時(shí)，芽孢數(shù)較多、芽孢率較高；培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀時(shí)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達(dá)最大值；另外，培養(yǎng)基中添加Mn2+有利于芽孢穩(wěn)定形成。綜合分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇糖蜜、黃豆粉、磷酸二氫鉀、硫酸錳為發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 不同培養(yǎng)基成分下菌株LY1 發(fā)酵液中的活菌數(shù)和芽孢數(shù)

2.3 多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵的PB 試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，確定了PB 試驗(yàn)的因素，按 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成“-1”和“1”2 個(gè)水平，以多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液中的芽孢數(shù)為響應(yīng)值，確定各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)孢的影響，從中篩選出有顯著影響的因素進(jìn)行下一步優(yōu)化。按照Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)PB 試驗(yàn)（表1），共16 組處理，每組3 個(gè)平行。

由表 1 和表 2 可知，糖蜜、黃豆粉、磷酸二氫鉀、初始pH 值和搖床轉(zhuǎn)速為正效應(yīng)，硫酸錳、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量為負(fù)效應(yīng)；回歸模型的P值=0.012 5＜0.05，相關(guān)性顯著，糖蜜、黃豆粉和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢影響極顯著（P＜0.01），而其他因素對(duì)多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢影響不顯著（P＞0.05）。

表1 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵的最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

以重要影響因子糖蜜、黃豆粉和搖床轉(zhuǎn)速的試驗(yàn)值變化梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素響應(yīng)值大小確定變化步長(zhǎng)，在32℃、初始pH 值8.0、裝液量30%、接種量4%的條件下培養(yǎng)，最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 可以看出，隨著重要影響因子濃度的增加，發(fā)酵液芽孢數(shù)的變化趨勢(shì)為先上升后下降，4號(hào)試驗(yàn)發(fā)酵液中芽孢數(shù)最多，達(dá) 5.079×109CFU/mL。故采用糖蜜17.5 g/L、黃豆粉17.5 g/L、搖床轉(zhuǎn)速260 r/min 進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化試驗(yàn)，其他條件為磷酸二氫鉀7.0 g/L、硫酸錳1.0 g/L、培養(yǎng)溫度32℃、接種量4%、初始pH 值8.0、裝液量30%。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)梯度設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵的中心組合試驗(yàn)結(jié)果

最陡爬坡試驗(yàn)確定了重要影響因子的取值區(qū)間，以糖蜜、黃豆粉和搖床轉(zhuǎn)速為自變量，分別用 X1、X2、X3表示，以多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行3 因素5 水平的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5 可知，模型的P值＜0.01，表明模型對(duì)響應(yīng)值Y 影響極顯著，且模型失擬項(xiàng)的P值為0.298 4（P＞0.05），影響不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.979 8，表明預(yù)測(cè)僅有2.02%的變異情況不能由該模型解釋，說(shuō)明建立的模型可以較好地反映不同條件下多粘類芽孢桿菌LY1 的產(chǎn)孢數(shù)變化情況，可以用回歸方程對(duì)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)孢情況進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表5 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

利用 Design Expert 8.0.6 對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，得到糖蜜、黃豆粉、搖床轉(zhuǎn)速3 者之間的響應(yīng)面圖，由圖3 可以看出，X1X2、X1X3等高線呈橢圓形，交互作用顯著，X2X3等高線近似圓形，交互作用不顯著，X1、X2、X3之間的交互作用響應(yīng)面存在最高點(diǎn)，說(shuō)明各因素間交互作用明顯，與方差分析結(jié)果一致。

圖3 不同因素間交互作用對(duì)芽孢含量影響的等高線和響應(yīng)曲面

利用Design-Expert8.0.6.1 軟件對(duì)表5 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到以下回歸方程預(yù)測(cè)模型：Y=7.744+0.657X1-0.607X2+0.006X3+0.197X1X2+0.118X1X3+0.027X2X3-0.328X12-0.262X22-0.748X32。

由模型和軟件分析得到最適多粘類芽孢桿菌LY1發(fā)酵產(chǎn)孢的糖蜜、黃豆粉、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)應(yīng)的參數(shù)分別為19.37 g/L、15.31 g/L、261 r/min，此條件下產(chǎn)孢數(shù)預(yù)測(cè)值為6.817×109CFU/mL。為了證實(shí)上述優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際產(chǎn)芽孢數(shù)為6.825×109CFU/mL，實(shí)測(cè)值與回歸方程預(yù)測(cè)值結(jié)果相近，說(shuō)明該研究所建立的數(shù)學(xué)模型可靠。

3 結(jié)論與討論

受發(fā)酵期間菌體數(shù)量、發(fā)酵后干燥期間菌體活性以及貯存期間菌體穩(wěn)定性等因素的影響，現(xiàn)有生防微生物制劑產(chǎn)品普遍存在活菌含量低、效價(jià)不高的問(wèn)題[16]，已成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。多粘類芽孢桿菌的芽孢具有極強(qiáng)的抗逆性，可耐受嚴(yán)苛的生存環(huán)境，是制備生防微生態(tài)制劑的理想形式，但芽孢的形成受諸多因素的影響，例如培養(yǎng)基成分、發(fā)酵培養(yǎng)條件以及復(fù)雜的代謝調(diào)理機(jī)制等[1,17-18]。該研究在搖瓶發(fā)酵條件下優(yōu)化了多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以芽孢數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)、PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)及響應(yīng)面分析，確定了多粘類芽孢桿菌LY1 的最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基配方為糖蜜19.37 g/L、黃豆粉15.31 g/L、磷酸二氫鉀7.0 g/L、硫酸錳1.0 g/L；在初始pH 值8.0、裝液量30%、培養(yǎng)溫度32℃、接種量4%、轉(zhuǎn)速261 r/min 的條件下培養(yǎng)發(fā)酵，芽孢數(shù)量達(dá)到6.825×109CFU/mL，這一結(jié)果同前期優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果相近，說(shuō)明該研究結(jié)果具有一定的穩(wěn)定性及可重復(fù)性，為進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝提供了必要的數(shù)據(jù)支撐。

芽孢是當(dāng)菌體遇到惡劣生存環(huán)境才會(huì)形成的一種休眠體，用以抵御嚴(yán)苛的生存環(huán)境，其本身不是細(xì)菌生活史中不可缺少的部分[17-19]。因此，除與菌種本身特性和培養(yǎng)基所含碳氮源、金屬離子及配比有關(guān)外，培養(yǎng)條件如溫度、溶氧量、pH 值等都有可能成為限制多粘類芽孢桿菌產(chǎn)孢的因素。試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)多粘類芽孢桿菌LY1 菌株最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的研究，以發(fā)酵液中芽孢數(shù)和芽孢轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，在獲得較多菌體的同時(shí)提高了其芽孢量和芽孢轉(zhuǎn)化率，相比王波等[8]的研究結(jié)果，芽孢數(shù)量提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，得到兼顧芽孢數(shù)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)孢培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，解決了以芽孢桿菌為主的生防微生物菌劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中存在的效價(jià)低問(wèn)題。該試驗(yàn)雖然得到了多粘類芽孢桿菌高密度培養(yǎng)條件和產(chǎn)孢培養(yǎng)基，但后續(xù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)以及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。