廖暑杰，王 丹，張昆朋，唐艷儀，揭雨成,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省草類(lèi)作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410128）

抗生素的合成是醫(yī)藥領(lǐng)域最偉大的成就之一，但長(zhǎng)期反復(fù)使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年有8 萬(wàn)人死于濫用抗生素。倍受人們關(guān)注的是，長(zhǎng)期采食添加抗生素飼料的動(dòng)物，其體內(nèi)的微生物產(chǎn)生抗藥性后通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，導(dǎo)致人體也產(chǎn)生抗藥性的問(wèn)題。而中草藥作為一種綠色安全的天然添加劑，可直接或間接作用于細(xì)菌等有害微生物，且不產(chǎn)生耐藥性[1]。綠原酸（Chlorogenic acid），分子式為C16H18O9，分子量354.31[2]。目前人們對(duì)綠原酸的研究已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用等多個(gè)領(lǐng)域。它是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[3]。

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)從綠色植物中提取的綠原酸能夠抑制和殺滅多種致病細(xì)菌。洪亮等[4]在金銀花、山銀花提取物綠原酸進(jìn)行體內(nèi)外抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抑菌作用。周志娥等[5]在研究綠原酸、異綠原酸A 對(duì)大腸桿菌抑菌機(jī)制中發(fā)現(xiàn)二者均可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞通透性增加，內(nèi)容物外泄。王明英等[6]發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物對(duì)大腸桿菌，沙門(mén)氏菌等腸道菌具有一定的抑制作用。

肖傳明等[7]在肉雞日糧中添加植物提取物替代抗生素進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，與抗生素組相比，試驗(yàn)組能顯著提高肉雞酶活力和消化率。唐保國(guó)等[8]在肉雞基礎(chǔ)日糧中分別添加由姜黃、柴胡、魚(yú)腥草、靈香草等組成的中草藥復(fù)方提取物（100 mg/kg）和吉他霉素（10 mg/kg）、金霉素+洛克沙砷（75+35 mg/kg）、黃霉素（5 mg/kg），進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，在肉雞日糧中添加中草藥可達(dá)到與抗生素相當(dāng)?shù)男Ч?。劉則學(xué)等[9]發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加5%的植物提取物綠原酸同樣具有良好的抗腹瀉和改善生產(chǎn)性能的作用，與抗生素效果相當(dāng)。李成洪等[10]提取杜仲、女貞子、黃芪等植物中多糖、齊墩果酸成分0.5%添加于生長(zhǎng)豬日糧中，發(fā)現(xiàn)植物提取物和金霉素均有提高生長(zhǎng)豬日增重、改善飼料利用效率和降低豬腹瀉的作用，且植物提取物促生長(zhǎng)效果和預(yù)防豬腹瀉效果優(yōu)于金霉素。陶新等[11]通過(guò)添加不同復(fù)合植物提取物飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)0.10%的復(fù)合植物提取物可替代飼用抗生素（金霉素+黃霉素），提高仔豬的生長(zhǎng)性能，且具有抗應(yīng)激和抗氧化功能。

苧麻是蕁麻科苧麻屬的多年生宿根型草本植物[12]，其綠原酸含量雖然比金銀花、杜仲、蒲公英偏低，但是，Blasco 等[13]發(fā)現(xiàn)，在熱帶地區(qū)飼料用的苧麻每年可以收獲14 次，鮮莖葉產(chǎn)量可達(dá)300 t/hm2，且我國(guó)是世界上最大的苧麻生產(chǎn)國(guó)，種植面積和產(chǎn)量占世界90%以上[14]。Maknev 等[15]研究發(fā)現(xiàn)飼喂苧麻粉的小牛比飼喂苜蓿粉的小牛長(zhǎng)得更快，出肉率更高，Cleasby 等[16]通過(guò)用苧麻葉喂養(yǎng)山羊和綿羊，發(fā)現(xiàn)苧麻葉是一種很好的補(bǔ)充飼料，Squibb[17]發(fā)現(xiàn)5%的苧麻干粉能夠預(yù)防幼雞疾病的產(chǎn)生，8%的苧麻干粉可使雞血液中的類(lèi)胡蘿卜素和維生素A 的含量顯著增加；Squibb[18]通過(guò)養(yǎng)豬試驗(yàn)研究植物飼料蛋白質(zhì)利用情況中發(fā)現(xiàn)，相比于黃豆，紫花苜蓿，香蕉葉，苧麻的效果最好；很多研究和生產(chǎn)實(shí)踐表明，中草藥替代抗生素效果明顯，但苧麻的草粉替代抗生素效果研究很少見(jiàn)報(bào)道。為此，開(kāi)展5 個(gè)高綠原酸飼用苧麻品種葉片、蘿卜根、繁殖根干粉提取液體外抗菌試驗(yàn)，篩選出殺菌效果最好的苧麻品種及器官，將該品種的苧麻草粉添加到動(dòng)物飼料中，可以促進(jìn)我國(guó)無(wú)抗飼料的生產(chǎn)和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試品種與測(cè)定材料參試苧麻品種為樂(lè)業(yè)灰綠苧、桐木苧麻、湘飼兼纖用苧麻1 號(hào)、紅尖麻、蘆竹青。將收獲后的苧麻分器官置于烘箱中，105 ℃殺青，65 ℃烘干至恒重，用小型植物粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80 目篩備用。測(cè)定材料為葉片、蘿卜根、繁殖根干粉。

1.1.2 苧麻干粉綠原酸提取液稱取1 g 苧麻干粉，加入50 mL pH 值為4 的50%乙醇浸泡24 h，40 ℃下超聲波輔助萃取30 min，過(guò)濾，洗滌。重復(fù)提取2 次，并合并濾液，110 ℃常壓蒸餾至25 mL（乙醇完全揮發(fā)）。

1.1.3 細(xì)菌種類(lèi)與抗生素細(xì)菌種類(lèi)為大腸桿菌、沙門(mén)氏菌。抗生素為鹽酸金霉素。

1.1.4 試驗(yàn)儀器超聲波清洗機(jī)，蒸餾裝置，TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋，TGL16離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同苧麻品種各器官綠原酸含量的測(cè)定采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定：制作綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定綠原酸含量。以比較5 個(gè)苧麻品種不同器官綠原酸的含量。

1.2.2 不同品種各器官干粉綠原酸提取液體外抑菌試驗(yàn)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法和比濁法進(jìn)行測(cè)定，原理是：細(xì)菌菌液的吸光度與其濃度成良好的線性關(guān)系，并且相應(yīng)的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果穩(wěn)定[19]。（1）普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制備：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.2，121 ℃，高壓滅菌20 min；（2）普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基制備：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 值為7.2，121 ℃，高壓滅菌20 min。（3）大腸桿菌與沙門(mén)氏菌菌懸液制備：將1 000 mL 的肉湯培養(yǎng)基分裝到10 個(gè)高壓滅菌處理過(guò)的錐形瓶?jī)?nèi)，5 個(gè)接種大腸桿菌，5個(gè)接種沙門(mén)氏菌，接種后放置于37 ℃、170 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h，600 nm 處測(cè)定吸光度值在1.1～1.2，放入4 ℃冰箱內(nèi)備用。

（4）不同品種各器官干粉綠原酸提取液對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果：在無(wú)菌工作臺(tái)上取1 mL 細(xì)菌菌懸液于5 mL 苧麻提取液，3 組重復(fù)，5 mL 50%的乙醇，5 mL 無(wú)菌水中，以無(wú)菌水作為對(duì)照組，放置于37 ℃、170 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h，以50%的乙醇菌液為空白，在600 nm 處測(cè)定吸光度。

1.2.3 不同品種葉片干粉提取液和金霉素體外抑菌試驗(yàn)KB-濾紙片法抑菌原理：將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周?chē)纬梢环N濃度梯度。在藥物擴(kuò)散的同時(shí)，紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)的測(cè)試菌不能生長(zhǎng)，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續(xù)生長(zhǎng)，從而在紙片的周?chē)纬赏该鞯囊志Α＃?）不同品種葉片干粉綠原酸提取液對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果：稱取10 g 過(guò)篩后的苧麻葉粉于燒杯中，加入pH 值為4 的50%的乙醇（固液比1 ∶50）浸泡24 h 后，40℃下超聲波輔助萃取30 min，過(guò)濾，洗滌，重復(fù)提取2 次，并合并濾液，常壓蒸餾至10 mL（相當(dāng)于生藥1 g/mL），將瓊脂培養(yǎng)基融化，取10 mL 于平板上，待凝固后加入0.1 mL 細(xì)菌菌懸液，三角耙均勻涂抹，用無(wú)菌鑷子將6 mm 無(wú)菌濾紙片浸泡于提取液中，貼在有菌的平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，每種提取液3 組重復(fù)；（2）金霉素對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果：配制1 g/mL 的金霉素溶液，取13 支無(wú)菌小試管，除第1 支外，每支試管加入3 mL 無(wú)菌水，取3 mL 1 g/mL的藥液于第2 支試管中，混勻后取3 mL 于第3 支試管中，以此類(lèi)推，到第13 支時(shí)，棄去3 mL，濾紙片法測(cè)量不同濃度抗生素抑菌圈大小，每個(gè)濃度的藥敏片3 組重復(fù)，抑菌圈直徑取平均值。試驗(yàn)分別以0.98、0.49 mg/mL 的金霉素作為抗生素對(duì)照組；（3）藥物對(duì)細(xì)菌抑制作用標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)抑菌圈為無(wú)敏，抑菌圈直徑10 mm，低度敏感；10 mm ≤抑菌圈直徑≤15 mm,中度敏感；抑菌圈直徑15 mm，高度敏感[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS 22.0 軟件的一般線性模型和比較平均值的LSD 法和SNK 法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種各器官綠原酸含量的分析

由圖1 可知，該5 個(gè)品種苧麻不同器官綠原酸含量具有差異性，葉片中的綠原酸含量最高，其次是繁殖根，蘿卜根最低。葉片綠原酸含量最高的品種是樂(lè)業(yè)灰綠苧，含量達(dá)0.82%，其次是紅尖麻、桐木苧麻，含量在0.46%～0.67%，湘飼纖兼用苧麻1 號(hào)和蘆竹青含量最低，僅0.15%～0.19%；蘿卜根中綠原酸含量差異不大，含量在0.10%～0.16%，繁殖根綠原酸含量最高的品種為樂(lè)業(yè)灰綠苧，達(dá)0.30%，蘆竹青、紅尖麻和桐木苧麻次之，含量在0.22%～0.27%，湘飼纖兼用苧麻1 號(hào)繁殖根綠原酸含量最低，為0.13%。

圖1 苧麻各器官綠原酸含量比較

2.2 不同品種各器官干粉綠原酸提取液的殺菌效果

由表1 可知，添加了苧麻各器官干粉綠原酸提取液的培養(yǎng)液OD600值均比對(duì)照組降低，從而苧麻干粉綠原酸提取液具有一定的殺菌效果。其中，添加葉片提取液對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌濃度影響比蘿卜根和繁殖根的大。

2.2.1 苧麻各器官干粉綠原酸提取液對(duì)大腸桿菌OD600值的影響表1 結(jié)果表明，無(wú)菌水對(duì)照的的大腸桿菌OD600值最高，為0.394。葉片中，樂(lè)業(yè)灰綠苧、紅尖麻和桐木苧麻的大腸桿菌OD600值（0.121～0.169）與無(wú)菌水對(duì)照的差異最明顯（P＜0.05），比無(wú)菌水對(duì)照下降了57.11%～69.29%，蘆竹青和苧麻1 號(hào)（0.234～0.245）也有明顯降低（P＜0.05）；蘿卜根中，樂(lè)業(yè)灰綠苧的大腸桿菌OD600值（0.190）與無(wú)菌水對(duì)照的差異最明顯（P＜0.05），比無(wú)菌水對(duì)照下降了51.78%，其他品種（0.215～0.298）無(wú)菌水對(duì)照的差異也顯著（P＜0.05）；繁殖根中，樂(lè)業(yè)灰綠苧、紅尖麻的大腸桿菌OD600值（0.243～0.259）與無(wú)菌水對(duì)照的差異明顯（P＜0.05），比無(wú)菌水對(duì)照下降了33.50%～38.32%，其他品種與無(wú)菌水對(duì)照無(wú)明顯差異。在同一品種中，抑菌效果的大小順序?yàn)槿~片＞蘿卜根＞繁殖根（P＜0.05），而各品種的平均抑菌效果差異較?。?.200～0.294）。

表1 苧麻各器官綠原酸提取液對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌濃度的影響

2.2.2 苧麻各器官干粉綠原酸提取液對(duì)沙門(mén)氏菌OD600值的影響表1 結(jié)果表明，葉片和繁殖根中，5 個(gè)品種的沙門(mén)氏菌OD600值均顯著低于無(wú)菌水對(duì)照（P＜0.05），其中，葉片中的樂(lè)業(yè)灰綠苧、紅尖麻和桐木苧麻與無(wú)菌水對(duì)照差異最明顯，沙門(mén)氏菌OD600值下降了62%左右。在同一品種中抑菌效果：葉片＞繁殖根＞蘿卜根（P＜0.05），各品種平均抑菌效果的大小順序?yàn)橥┠酒r麻（0.267）＞樂(lè)業(yè)灰綠苧（0.280）＞紅尖麻（0.288）＞蘆竹青（0.317）＞苧麻1 號(hào)（0.392）。

2.3 不同品種葉片干粉綠原酸提取液與抗生素的抑菌效果比較

測(cè)量不同濃度抗生素對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)抗生素濃度在31.25～500 mg/mL 對(duì)大腸桿菌的抑制效果為高度敏感，在3.91～15.63 mg/mL對(duì)大腸桿菌的抑制效果為中度敏感，低于3.91 mg/mL為低度敏感，低于0.98 mg/mL 為無(wú)敏；抗生素濃度在7.81～500 mg/mL 對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制效果為高度敏感，在3.91～7.81 mg/mL 區(qū)間的抑制效果為中度敏感，低于3.91 mg/mL 的抑制效果為低度敏感，低于0.49 mg/mL 為無(wú)敏。

由表2 可知，將1 g/mL 樂(lè)業(yè)灰綠苧、紅尖麻、桐木苧麻的葉片提取液與0.98 mg/mL 的抗生素對(duì)大腸桿菌的殺菌效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，桐木苧麻和樂(lè)業(yè)灰綠苧的葉片提取液與0.98 mg/mL 抗生素對(duì)大腸桿菌的抑制效果差異不明顯，紅尖麻的葉片提取液與該濃度抗生素差異明顯（P＜0.05）。

表2 苧麻葉片干粉綠原酸提取液對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑制效果

將1 g/mL 樂(lè)業(yè)灰綠苧、紅尖麻、桐木苧麻的葉片提取液與0.49 mg/mL 的抗生素對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，桐木苧麻的葉片提取液與0.49 mg/mL 抗生素對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果無(wú)明顯差異，而樂(lè)業(yè)灰綠苧和紅尖麻與該濃度抗生素差異明顯（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

5 個(gè)苧麻品種不同器官綠原酸含量，以葉片最高，其次是繁殖根，蘿卜根最低。葉片綠原酸含量最高的品種是樂(lè)業(yè)灰綠苧，為0.82%，其次是紅尖麻，桐木苧麻，為0.4%～0.8%。添加苧麻各器官干粉提取液的培養(yǎng)液OD600值均比對(duì)照組低，在同一品種中，葉片提取液對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌濃度影響最大，差異最明顯（P＜0.05），其OD600值只有0.121～0.245（對(duì)照0.394）和0.149～0.263（對(duì)照0.402）。1 g/mL 桐木苧麻和樂(lè)業(yè)灰綠苧的葉片提取液與0.98 mg/mL 抗生素對(duì)大腸桿菌的抑制效果差異不明顯（P＜0.05），相當(dāng)于1 kg 的桐木苧麻或樂(lè)業(yè)灰綠苧的葉粉提取液可替代980 mg 的金霉素，這與我國(guó)規(guī)定豬飼料中添加1 330 mg/kg 金霉素用于治療疾病的劑量相近。1 g/mL 桐木苧麻的葉片綠原酸提取液與0.49 mg/mL 抗生素對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果無(wú)明顯差異，相當(dāng)于1 kg 桐木苧麻的葉粉提取液可替代490 mg 的金霉素，該劑量處于豬飼料中添加330～670 mg/kg 金霉素用于防止疾病的劑量。

試驗(yàn)選用的抗生素為金霉素，是一種對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，陰性菌，大型病毒，螺旋體等有抑制作用的四環(huán)素類(lèi)廣譜抗生素[21]，養(yǎng)殖戶用它來(lái)預(yù)防動(dòng)物疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[22]。但是，儂天濤[23]在研究中發(fā)現(xiàn)金霉素的使用在豬肉制品和豬糞便中均有殘留，對(duì)豬肉的品質(zhì)和土壤微生物造成不利影響。大量研究表明，綠色植物提取物可抑制和殺滅多種致病細(xì)菌，此試驗(yàn)得到了一致的結(jié)論。但是通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，并非綠原酸濃度越高，抑菌效果越好，這可能與提取液中含有其他天然有效殺菌成分有關(guān)，因?yàn)槠r麻葉中除了綠原酸以外，還含有多種黃酮類(lèi)物質(zhì)[24]，Cushnie 等[25]發(fā)現(xiàn)，富含黃酮類(lèi)物質(zhì)的天然植物對(duì)耐抗生素的細(xì)菌具有良好的抑制作用。王賢芳等[26]用添加6%的苧麻草粉混合飼料與普通蛋雞混合飼料飼喂，發(fā)現(xiàn)蛋雞死亡率降低50 %。鄧羅偉等[27]在研究苧麻草粉不同添加水平（添加5%、10%、15%的苧麻草粉于仔豬的日糧中）對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響中發(fā)現(xiàn)取食添加苧麻草粉日糧的仔豬腹瀉率和疾病發(fā)生率都要比取食未添加組低。由此可以看出，苧麻草粉作為飼料添加劑是完全可行的，此試驗(yàn)僅證明苧麻葉片提取液具有體外抑菌效果，其能否替代動(dòng)物飼料中的抗生素，還需進(jìn)行飼喂試驗(yàn)。此試驗(yàn)采用的萃取劑為pH 值4 的50%乙醇，乙醇本身所具有的殺菌能力，但其具有揮發(fā)性且作用不穩(wěn)定，濃縮藥液過(guò)程中，乙醇揮發(fā)較完全，可忽略乙醇對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的影響。