孟潔潔，宋 月，樊文杰，楊 樂，邢嘉友，王 江，褚貝貝，楊國(guó)宇，王夢(mèng)迪

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046)

水皰性口炎(vesicular stomatitis，VS)又稱爛舌癥，是由水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)引起牛、馬、豬等哺乳動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病，以水皰性病變?yōu)樘卣鳎赏ㄟ^摩擦接觸破損的動(dòng)物皮膚引起感染，最早出現(xiàn)在美國(guó)[1-2]。VS的流行具有季節(jié)性、暴發(fā)性的特點(diǎn)，較易在夏季發(fā)生，通?？稍? h內(nèi)侵犯牧場(chǎng)內(nèi)的大批牲畜，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。VSV屬于單股負(fù)鏈RNA(single stranded negative stranded RNA，ssRNA)病毒，也是一種能夠由昆蟲傳播的橫紋肌病毒，它具有囊膜，并在小鼠中具有神經(jīng)毒性[3]，是由包括狂犬病毒在內(nèi)的嗜神經(jīng)病毒組成的彈狀病毒家族的原型成員。水皰性口炎是由VSV中的糖蛋白G在病毒吸附、內(nèi)吞和膜融合過程中介導(dǎo)的[1]。糖蛋白G作為VSV的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，可以與Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)相互作用并激活自噬，從而啟動(dòng)抗病毒程序[4-6]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是先天免疫中的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，可以通過與配體相互識(shí)別被激活，使信號(hào)向下游傳遞，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TLRs至少有11種，均屬于Ⅰ型跨膜蛋白，TLR7也不例外，它由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分組成，其中胞外區(qū)可與配體相互識(shí)別，跨膜區(qū)含有較多的半胱氨酸，胞內(nèi)區(qū)與白細(xì)胞介素受體同源，負(fù)責(zé)信號(hào)傳遞。TLR7還能夠特異性識(shí)別短鏈RNA及其核苷類似物，在與其配體特異性結(jié)合后，通過信號(hào)傳導(dǎo)最終可以促進(jìn)Ⅰ型干擾素的表達(dá)，參與到抵抗單鏈RNA病毒感染的天然免疫中[7-11]。本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)修飾技術(shù)構(gòu)建PK15細(xì)胞TLR7基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞系，并研究TLR7基因敲除對(duì)VSV-GFP毒株復(fù)制規(guī)律的影響，以期為防控VSV等RNA病毒引起的疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

豬腎上皮細(xì)胞(porcine renal epithelial cells，PK15)、人胚腎上皮細(xì)胞衍生細(xì)胞系(human embryonic renal epithelial cell derived cell line，HEK293T/17)、非洲綠猴腎上皮細(xì)胞(renal epithelial cells of African green monkey，Vero)、VSV-GFP毒株、大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存；LentiCRISPR V2、pMD2.G以及pSPA×2均購(gòu)自Addgene公司；T7核酸內(nèi)切酶及T7 NEBuffer均購(gòu)自NEB公司；一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京密碼子生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；嘌呤霉素、血清、培養(yǎng)基等均購(gòu)自Thermo公司；CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的豬源TLR7基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001097434.1)進(jìn)行sgRNA預(yù)測(cè)，最終設(shè)計(jì)sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3序列用于TLR7基因敲除。此外，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找豬源VSV-N基因的mRNA序列 (GenBank登錄號(hào)：MK934319.1)，并利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 TLR7-sgRNA載體構(gòu)建

LentiCRISPR v2質(zhì)粒在BsmBⅠ酶的作用下于37 ℃反應(yīng)1 h完成單酶切，在電泳并回收后，利用合成的sgRNA引物對(duì)分別進(jìn)行以下反應(yīng)。引物退火雜交的程序?yàn)椋?5 ℃變性10 min;95 ℃梯度退火至85 ℃(每秒鐘降低2 ℃)，85 ℃梯度退火至25 ℃(每秒鐘降低0.1 ℃);4 ℃保存1 h。在T4 DNA連接酶的作用下，酶切所得大片段與上述產(chǎn)物在4 ℃過夜反應(yīng)。轉(zhuǎn)化搖菌涂布平板，然后置于37 ℃溫箱中過夜生長(zhǎng)，挑取形狀色澤等良好的單菌落送測(cè)序。選取測(cè)序無誤的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，稀釋成1 000 ng/μL。

表1 引物信息

續(xù)表

1.4 TLR7基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建

1.4.1 慢病毒包裝 將HEK293T/17細(xì)胞接種于T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞融合度達(dá)到40%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將包裝質(zhì)粒(pMD2.G)、包膜蛋白質(zhì)粒(pSPAX2)與構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T/17細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48、72 h后收取上清液，將其混合后得到慢病毒液,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 多克隆細(xì)胞株篩選 將PK15細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到40%左右時(shí)進(jìn)行慢病毒感染。取1 mL慢病毒液混合1 mL DMEM處理PK15細(xì)胞。當(dāng)慢病毒感染細(xì)胞48 h后，用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(含有8 μg/mL嘌呤霉素)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)未感染細(xì)胞被殺死后，即可留下所需的陽(yáng)性細(xì)胞。以未作處理的PK15細(xì)胞為對(duì)照,當(dāng)對(duì)照組細(xì)胞全部死亡時(shí)，將嘌呤霉素濃度更換為3 μg/mL再進(jìn)行培養(yǎng)，最后將篩選出來的多克隆細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.4.3 Western blotting檢測(cè)sgRNA編輯效率 分別接種PK15及篩選出來的3株多克隆細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿細(xì)胞數(shù)為7×105個(gè)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時(shí)收取目的蛋白，將得到的蛋白進(jìn)行BCA濃度檢測(cè)后，取相應(yīng)量蛋白進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂乳室溫封閉1 h后，加入TLR7單克隆抗體(1∶1 000稀釋)過夜(4 ℃)，利用1×TBST洗膜3次后，用山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)孵育1 h，利用1×TBST洗膜3次后進(jìn)行顯影，所選用內(nèi)參蛋白為β-actin。

1.4.4 單克隆細(xì)胞系的篩選 選取編輯效率高的多克隆細(xì)胞，通過有限稀釋法進(jìn)行單克隆細(xì)胞系的篩選。再分別將PK15細(xì)胞與所得的PK15-TLR7-/-單克隆細(xì)胞系接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按照1.4.3方法收取蛋白并進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步提取PK15-TLR7-/-單克隆細(xì)胞系基因組并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

將PK15、PK15-TLR7-/-細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，于0、6、12、24、36、48 h在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)、大小以及密集程度并拍照。

1.6 CCK-8檢測(cè)

將PK15、PK15-TLR7-/-細(xì)胞接種于96孔板中，分別于0、6、12、24、36、48 h進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)重復(fù)，加入CCK-8處理后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，分別檢測(cè)2種細(xì)胞在450 nm處的吸光度值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

將PK15、PK15-TLR7-/-細(xì)胞接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用VSV-GFP感染細(xì)胞，病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.01。將計(jì)算好的病毒量加入DMEM，混合的病毒懸液渦旋8 s后處理細(xì)胞，于37 ℃吸附 1 h后棄去原培養(yǎng)基，PBS清洗后再加入新鮮含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別于0、6、12、24、36 h觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光情況并記錄，同時(shí)按照時(shí)間點(diǎn)收樣并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

將PK15、PK15-TLR7-/-細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，利用VSV-GFP感染細(xì)胞，MOI為0.01。按照1.7方法進(jìn)行處理后，分別于0、2、4、6、12、24、36 h進(jìn)行收樣，先加入Trizol進(jìn)行總RNA提取。獲得總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ 5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 2.7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；繪制熔解曲線，25 ℃反應(yīng)1 min。

1.9 Western blotting 檢測(cè)VSV-GFP的GFP蛋白的表達(dá)

分別將PK15、PK15-TLR7-/-細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，利用VSV-GFP感染細(xì)胞，MOI為0.01。按照1.7方法進(jìn)行處理后，分別于0、4、6、12、24、36 h收樣并提取目的蛋白。一抗為GFP單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，二抗為山羊抗鼠IgG(1∶5 000)，洗膜液為1×TBST，內(nèi)參蛋白為β-actin，方法同1.4.3。

1.10 VSV-GFP子代病毒滴度測(cè)定

分別將PK15、PK15-TLR7-/-細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以VSV-GFP感染細(xì)胞，MOI為0.01。按照1.7方法進(jìn)行處理后，分別于0、4、6、12、24、36 h進(jìn)行收樣，將樣品反復(fù)凍融且每次凍存時(shí)間不少于8 h，凍融3次后在超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取上清吹打底部的細(xì)胞碎片，離心后留取上清液。在96孔板中接種Vero細(xì)胞，設(shè)置12個(gè)病毒濃度梯度，以10倍為一個(gè)濃度差進(jìn)行倍比稀釋后處理細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，棄去培養(yǎng)基，用1×PBS清洗2次，換成含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每隔1 d觀察1次，5～6 d后，觀察細(xì)胞病變情況，記錄病變孔并計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)，最終得到VSV-GFP子代病毒滴度變化。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每種試驗(yàn)均重復(fù)3次，利用Excel軟件整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行雙尾T檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用GraphPad Prism 8.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 載體鑒定結(jié)果

用BsmBⅠ對(duì)LentiCRISPR v2載體單酶切后進(jìn)行電泳檢測(cè)，以LentiCRISPR v2質(zhì)粒作為對(duì)照，結(jié)果顯示該載體單酶切后有13 000和1 873 bp 2個(gè)目的條帶(圖1A)，與預(yù)期一致。 測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTLR7-sgRNA1、pTLR7-sgRNA2和pTLR7-sgRNA3(圖1B)。

A，LentiCRISPR v2酶切電泳圖:M，DL15000 DNA Marker；1，LentiCRISPR v2質(zhì)粒；2，LentiCRISPR v2單酶切產(chǎn)物。B，序列測(cè)定結(jié)果A，Enzyme-digestion electrophoresis of LentiCRISPR v2:M，DL15000 DNA Marker;1，Plasmid LentiCRISPR v2;2，Results of LentiCRISPR v2 enzyme digestion.B，Sequence determination results圖1 Cas9/sgRNA載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of the Cas9/sgRNA vector

2.2 PK15-TLR7-/-單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建

Western blotting檢測(cè)3個(gè)sgRNA構(gòu)建的PK15-TLR7-/-多克隆細(xì)胞，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3均可對(duì)TLR7基因進(jìn)行有效編輯，其中編輯效率最高的為sgRNA2(圖2A)。將編輯效率最高的sgRNA2構(gòu)建的PK15-TLR7-/-多克隆細(xì)胞所篩選得到的單克隆細(xì)胞系進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示，無TLR7蛋白表達(dá)(圖2B)。測(cè)序結(jié)果表明，與正常TLR7基因相比，2號(hào)靶位點(diǎn)處插入堿基A導(dǎo)致后續(xù)堿基發(fā)生移碼突變，證明PK15-TLR7-/-敲除細(xì)胞構(gòu)建成功(圖2C)。

A，Western blotting檢測(cè)sgRNA編輯效率:1、2，分別為PK15細(xì)胞、sgcontrol細(xì)胞；3～5，分別為用sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3構(gòu)建的PK15-TLR7-/-多克隆細(xì)胞。B，Western blotting檢測(cè)PK15細(xì)胞和PK15-TLR7-/-單克隆細(xì)胞中TLR7蛋白的表達(dá)情況。C，PK15-TLR7-/-單克隆細(xì)胞測(cè)序結(jié)果A,Western Blotting results of sgRNA editing efficiency detection:1 and 2，PK15 cells and sgcontrol cells,respectively;3-5，PK15-TLR7-/- polyclonal cells constructed with sgRNA1,sgRNA2 and sgRNA3,respectively.B，Western blotting results of TLR7 protein expression in PK15 cells and PK15-TLR7-/- monoclonal cells detection.C，Results of PK15-TLR7-/- monoclonal cell sequencing圖2 單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建Fig.2 Construction of monoclonal cell lines

2.3 TLR7基因敲除對(duì)PK15細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響

通過光學(xué)顯微鏡在不同時(shí)間點(diǎn)觀察PK15與PK15-TLR7-/-的細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，敲除TLR7基因并不影響PK15的細(xì)胞形態(tài)(圖3A)。利用CCK-8檢測(cè)敲除TLR7基因?qū)K15細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)，PK15-TLR7-/-細(xì)胞的活力與PK15細(xì)胞無顯著差異(P>0.05)(圖3B)。

2.4 PK15細(xì)胞中TLR7基因敲除對(duì)VSV-GFP復(fù)制的影響

在VSV-GFP感染PK15細(xì)胞與PK15-TLR7-/-細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)，通過熒光顯微鏡進(jìn)行熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間增加，熒光強(qiáng)度逐次增加，且PK15-TLR7-/-細(xì)胞的GFP熒光強(qiáng)度強(qiáng)于PK15細(xì)胞(圖4A)；與此同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相同時(shí)間點(diǎn)的PK15-TLR7-/-細(xì)胞感染VSV-GFP的比例顯著或極顯著高于PK15細(xì)胞(P<0.05；P<0.01)(圖4B和4C)，表明敲除TLR7基因促進(jìn)了VSV-GFP在PK15細(xì)胞中的復(fù)制。

2.5 PK15細(xì)胞中TLR7基因敲除對(duì)VSV-N基因mRNA水平的影響

當(dāng)VSV-GFP感染PK15與PK15-TLR7-/-細(xì)胞后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)VSV-N基因mRNA相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間增加，VSV-N基因mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸增加。感染4～36 h時(shí)，PK15細(xì)胞中VSV-N基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著低于PK15-TLR7-/-細(xì)胞(P<0.05；P<0.01)(圖5)，表明敲除PK15細(xì)胞中TLR7基因能顯著促進(jìn)VSV-N基因表達(dá)。

2.6 PK15細(xì)胞中TLR7基因敲除對(duì)VSV-GFP GFP蛋白表達(dá)的影響

當(dāng)VSV-GFP感染PK15與PK15-TLR7-/-細(xì)胞后，Western blotting檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)VSV-GFP GFP蛋白的表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)，PK15與PK15-TLR7-/-細(xì)胞中的VSV-GFP GFP蛋白均從6 h開始表達(dá)，并且隨著時(shí)間的增加，VSV-GFP GFP蛋白的表達(dá)量均逐漸增多，但相較于PK15細(xì)胞來說，在PK15-TLR7-/-細(xì)胞中VSV-GFP GFP蛋白含量更高(圖6)，因此，在PK15細(xì)胞中敲除TLR7基因能夠促進(jìn)VSV病毒的復(fù)制。

*，差異顯著(P<0.05)，**，差異極顯著(P<0.01)，ns，差異不顯著(P>0.05)。下同*,Significant difference (P <0.05),**,Extremely significant difference (P<0.01),ns,No significant difference (P>0.05).The same as below圖3 PK15與PK15-TLR7-/-細(xì)胞的形態(tài)(A)與活力(B)Fig.3 Morphology (A) and activity (B) of PK15 and PK15-TLR7-/- cells

A，熒光顯微鏡觀察結(jié)果(40×)；B，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；C，不同時(shí)間VSV-GFP的感染率A，Results of fluorescence microscopy (40×);B，The results of flow cytometry;C，Results of infection rate of VSV-GFP at different time圖4 TLR7基因敲除對(duì)VSV-GFP復(fù)制的影響Fig.4 Effect of TLR7 gene knockout on replication of VSV-GFP

圖5 TLR7基因敲除對(duì)VSV-N基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of TLR7 gene knockout on VSV-N gene mRNA expression

圖6 TLR7基因敲除對(duì)VSV-GFP GFP蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of TLR7 gene knockout on VSV-GFP GFP protein expression

2.7 PK15細(xì)胞中TLR7基因敲除對(duì)VSV-GFP子代病毒滴度的影響

當(dāng)VSV-GFP感染PK15與PK15-TLR7-/-細(xì)胞后，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)VSV-GFP子代病毒滴度，結(jié)果表明，感染VSV-GFP 6 h后子代病毒開始釋放，此時(shí)PK15細(xì)胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7-/-細(xì)胞，但差異不顯著(P>0.05)；隨著VSV-GFP感染時(shí)間的增加，PK15細(xì)胞中VSV-GFP子代病毒滴度顯著或極顯著低于PK15-TLR7-/-細(xì)胞(P<0.05；P<0.01)(圖7)。說明TLR7基因敲除能夠促進(jìn)VSV-GFP子代病毒的產(chǎn)生。

圖7 TLR7基因敲除對(duì)VSV-GFP子代病毒滴度的影響Fig.7 Effect of TLR7 gene knockout on titer of VSV-GFP progeny virus

3 討 論

本試驗(yàn)選擇豬PK15細(xì)胞作為研究對(duì)象，并利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得PK15-TLR7-/-穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系。 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA精準(zhǔn)修飾的技術(shù)[12]，作為ZFN和TALEN后的第3代基因編輯技術(shù)，它具有經(jīng)濟(jì)快捷、操作簡(jiǎn)便、效率高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因功能的挖掘、動(dòng)植物品系的培育以及動(dòng)物模型的建立等研究領(lǐng)域[13-15]。Xu等[16]利用該技術(shù)制備了無外源標(biāo)記的CD163和pAPN雙等位基因編輯豬，在不影響豬正常生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能的前提下，顯著降低了對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的易感性。Yang等[17]使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與體細(xì)胞核移植(SCNT)相結(jié)合，獲得了血紅蛋白清道夫受體CD163基因敲除的杜洛克豬，并證明了敲除CD163基因的杜洛克豬可完全抵抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。Hübner等[18]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)靶向切割A(yù)SFV-p30基因組，導(dǎo)致由ASFV引起的空斑完全消失，最終使病毒產(chǎn)量降低了4個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以用于研究病毒與宿主細(xì)胞的聯(lián)系、病毒的致病機(jī)理等。

TLR7基因于2000年發(fā)現(xiàn)[19]，它廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞的內(nèi)體-溶酶體中，能夠識(shí)別某些小分子的抗病毒化合物和病毒mRNA介導(dǎo)的抗病毒的天然免疫反應(yīng)[19-21]。 當(dāng)TLR7被活化后，能夠招募髓系分化因子88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)，進(jìn)而使MyD88活化并招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK)，形成4層左手螺旋狀信號(hào)復(fù)合物，使信號(hào)向下游傳遞，最終導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor 7，IRF7)磷酸化后入核，產(chǎn)生Ⅰ型干擾素以發(fā)揮抗病毒作用[22]。如Martin等[23]通過利用呼吸道合胞病毒感染BALB/c小鼠發(fā)現(xiàn)，TLR7的表達(dá)量上升，同時(shí)釋放了細(xì)胞因子IRF5；Diebold等[24]用聚乙烯亞胺與濃縮流感病毒ssRNA的復(fù)合物(PEI-RNA)活化野生型小鼠骨髓細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α，但不能活化TLR7-/-小鼠的骨髓細(xì)胞。此外，VSV的宿主非常廣泛，能夠感染植物、無脊椎動(dòng)物和有脊椎動(dòng)物，實(shí)際生產(chǎn)中也會(huì)引起豬急性、熱性、高度接觸性的傳染病[25]。而Lund等[26]用VSV或流感病毒體外感染鼠骨髓細(xì)胞，可分泌高水平的IFN-α和白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)，而TLR7-/-小鼠來源的骨髓細(xì)胞喪失了對(duì)VSV的反應(yīng)，也表明TLR7能夠活化免疫細(xì)胞，并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，從而發(fā)揮抗病毒機(jī)制。因此，宿主細(xì)胞能夠通過TLR7識(shí)別病毒的RNA，從而啟動(dòng)TLR7依賴的抗病毒機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR7基因敲除可以促進(jìn)VSV在PK15細(xì)胞中的復(fù)制，但不影響PK15細(xì)胞的形態(tài)及活力，進(jìn)一步驗(yàn)證了TLR7在宿主細(xì)胞抗病毒中扮演著重要的角色。但VSV如何與TLR7相互作用以及TLR7影響病毒復(fù)制生活周期中的哪一階段，仍需進(jìn)一步研究證明。本研究初步驗(yàn)證了TLR7在天然免疫中的作用，為VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新的思路和策略。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了豬pTLR7-sgRNA重組質(zhì)粒并最終得到了PK15-TLR7-/-單克隆細(xì)胞系，通過檢測(cè)敲除TLR7基因?qū)SV-GFP復(fù)制情況的影響，證明敲除TLR7基因在一定程度上促進(jìn)了VSV復(fù)制。