黃瀟航，李詩藝，李永霞，李夢蕊，賀金峪，張 龍，劉道泉，江和基，黃志堅，殷光文

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.福建省動物藥物工程實驗室，福州 350002；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；4.福州市動物疫病預(yù)防控制中心，福州 350009)

中華蟾蜍屬兩棲綱蟾蜍科動物,在中國廣泛分布。蟾皮、蟾酥、干蟾、蟾蜍頭、蟾蜍膽、蟾蜍肝等名貴中藥材均產(chǎn)自蟾蜍，在臨床應(yīng)用效果較好[1]。其中，耳后腺分泌物——蟾酥在臨床中具有抗菌、消炎等功效。蟾蜍相關(guān)成分如蟾酥、蟾蛻等均具有較高的藥用價值，目前國內(nèi)生產(chǎn)的中成藥中，“蟾酥注射液”、“復(fù)方蟾皮膠囊”等含有蟾蜍成分的中成藥已經(jīng)超過了100種[2]。

棘頭蟲是一類常見的蠕蟲，其吻部具有倒鉤小刺狀結(jié)構(gòu)，蟲體較大，肉眼可見，生活史復(fù)雜，多見其寄生于動物腸道內(nèi)，偶見其他臟器的移行性寄生,在豬和水禽中感染較常見,大量寄生易造成動物宿主的腸黏膜等組織器官機械性損傷，繼發(fā)炎癥。兩棲動物棘頭蟲感染種類較為豐富，夏偉麗等[3]整理的蛙類棘頭蟲感染名錄中指出國內(nèi)在蛙體內(nèi)檢出棘頭蟲8種，隸屬于1門、2綱、2目、2科、3屬。此外，關(guān)于兩棲動物棘頭蟲的感染報道及蛙棘頭蟲等感染情況，多數(shù)研究以形態(tài)學(xué)鑒定研究為主，分子生物學(xué)方面的研究報道相對較少。形態(tài)學(xué)鑒定對鑒定者具有較高的專業(yè)素質(zhì)要求，且對于幼蟲等生活史階段鑒別難度較大。

近年來興起的分子生物學(xué)成為了物種鑒定的一種較好的選擇，線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)對物種演化研究具有重要參考價值，該基因片段具有變異頻率高、種間差異性顯著等特點，目前在國內(nèi)線蟲[4]和絳蟲[5]等蠕蟲、甚至節(jié)肢動物[6-7]的種類鑒定上已有了較成熟的應(yīng)用。本研究解剖死亡蟾蜍，在體腔臟器上發(fā)現(xiàn)了大量棘頭蟲感染現(xiàn)象，采用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定綜合分析，以期為兩棲類棘頭蟲等寄生蟲的分類、鑒定和遺傳變異研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

10%中性福爾馬林溶液(4%甲醛)購自泉州泓克生物科技有限公司；滅菌生理鹽水、手術(shù)器械、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒均購自北京索萊寶生物公司；DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit)購自MP Biomedicals公司；EasyTaqMix聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。正置白光拍照顯微鏡Eclipse Ci-L(Nikon(Japan))、掃描瀏覽軟件CaseViewer2.4(3DHISTECH(Hungary))、全景切片掃描儀PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000(3DHISTECH(Hungary))；SZ680連續(xù)變倍體視顯微鏡和SMAR顯微鏡均購自重慶奧特光學(xué)儀器責任有限公司。

1.2 動物檢查

實驗室飼養(yǎng)的一只體重153 g的雌性藥用中華蟾蜍，形態(tài)消瘦，疑似患有寄生蟲病，拒食后發(fā)生死亡，對死亡的蟾蜍進行剖檢發(fā)現(xiàn)，多臟器及系膜處有大量棘頭蟲感染寄生。對病死蟾蜍的皮下肌肉、口腔、咽、食道、胃、肺臟、小腸等依次進行剖檢觀察，除了采集病理組織部分外，其余均做完全剖檢處理，并統(tǒng)計感染蟲數(shù)。

1.3 病理組織學(xué)觀察

對感染較嚴重的器官進行蟲體感染計數(shù)后，采集部分組織樣品浸泡于10%中性福爾馬林溶液，標本固定后由福州都拜特生物公司進行病理組織學(xué)標本的制備。使用HE染色方法進行病理組織切片的制備,參照病理組織學(xué)相關(guān)分析方法對組織樣品進行研究。

1.4 傳統(tǒng)方法檢測

采用蠕蟲剖檢法、結(jié)節(jié)壓片法、飽和食鹽水漂浮法、水洗沉淀法進行寄生蟲檢測，用SZ680連續(xù)變倍體視顯微鏡對感染棘頭蟲的病變情況進行觀察，并拍攝記錄。采用結(jié)節(jié)壓片法檢查腸道結(jié)節(jié)內(nèi)的棘頭蟲，并使用光學(xué)顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察。臨床操作及形態(tài)學(xué)鑒定參照孔繁瑤[8]方法進行。在統(tǒng)計計數(shù)后，保存部分臟器寄生的棘頭蟲用于后期的分子生物學(xué)鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

用DNA提取試劑盒對來自心臟、肝臟、胃、腸、生殖腺的5株蟲體進行DNA提取，樣品編號為JS-01～JS-05，以提取的DNA為模板進行PCR反應(yīng)。COⅠ基因擴增引物為LCO1490：5′-GGTCAA-CAAATCATAAAGATATTGG-3′；HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[7]，引物由福州尚亞生物公司合成制備。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×FineTaqMix 酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，47 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min,共35個循環(huán)；68 ℃總延伸7 min。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴增獲得的陽性條帶切膠回收送往福州鉑尚公司進行測序。測序后獲得的序列使用DNAMAN和Mega 7.0軟件進行生物信息學(xué)分析，選取代表株JS-01使用DNAStar 7.0軟件進行相似性比對分析。用Mega 7.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建基于COⅠ基因序列的系統(tǒng)進化樹，采用Boostrad測量重復(fù)1 000次。

2 結(jié) 果

2.1 臨床剖檢結(jié)果

臨床剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棘頭蟲寄生于蟾蜍的肺臟、肝臟、胃、卵巢、脾臟等多個臟器，未發(fā)現(xiàn)線蟲、絳蟲、吸蟲等其他臨床常見的蠕蟲寄生，初步判斷本病例中導(dǎo)致蟾蜍發(fā)生虛弱死亡的致病原為棘頭蟲。感染數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 棘頭蟲感染寄生部位及感染情況

2.2 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

采集病理組織，HE染色結(jié)果顯示，在棘頭蟲感染寄生的部位均出現(xiàn)了較嚴重的機械損傷和炎癥反應(yīng)。病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，棘頭蟲的感染造成了空腸黏膜機械性壓迫和損傷(圖1A)；肺臟寄生造成了肺臟黏膜層的機械性損傷和出血(圖1B)；肝臟寄生造成了鐵血黃素增加，充血及伴有大量的炎性反應(yīng)(圖1C)；脾臟充血腫大，鐵血黃素增加，伴有部分細胞壞死(圖1D)；心肌壞死，有炎性細胞浸潤(圖1E)；胃基底層完整，但胃黏膜嚴重脫落，且胃壁外側(cè)有大量蟲體寄生(圖1F)；腸腔道內(nèi)膜損傷較嚴重，腸絨毛完整性破壞，內(nèi)部可觀察到炎性細胞聚集(圖1G)；直腸外壁可觀察到大量的蟲體呈現(xiàn)機械性寄生，組織結(jié)構(gòu)完整性大量破壞(圖1H)；卵巢組織內(nèi)可觀察到大量寄生個體，造成卵巢組織損壞嚴重(圖1I)。

A，回腸；B，肺臟；C，肝臟；D，脾臟；E，心臟；F，胃；G，十二指腸；H，直腸；I，卵巢A,Ileum;B,Lung;C,Liver;D,Spleen;E,Heart;F,Stomach;G,Duodenum;H,Rectum;I,Ovaries圖1 蟾蜍棘頭蟲感染病理組織學(xué)觀察(100×)Fig.1 Histopathological observation on the infection of Sphaerirostris lanceoides in toad (100×)

2.3 傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果

通過水洗沉淀法和飽和食鹽水漂浮法對腸道內(nèi)容物進行了檢測,未發(fā)現(xiàn)蟲卵。同時采集寄生組織壓片進行光學(xué)形態(tài)觀察，蟲體具有較長的吻部，其中具有大量的鉤刺結(jié)構(gòu)，在蟲體內(nèi)未觀察到蟲卵，初步判斷體腔內(nèi)寄生的蠕蟲為棘頭蟲(圖2)。用70%酒精溶液浸泡保存部分蟲體樣本，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)棘頭蟲638只，其中腸、胃、膀胱、肝臟感染強度最高。形態(tài)學(xué)鑒定比對結(jié)果顯示，分離的棘頭蟲與似矛球吻棘頭蟲特征相符。

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

感染5個不同部位的5株棘頭蟲蟲株COⅠ基因PCR擴增獲得大小約為688 bp的目的片段(圖3)。 通過拼接測序獲得條帶大小為690～710 bp，GC含量為40.14%～40.83%。使用DNAMAN進行相似性分析，5株目的蟲株多序列比對mtCOⅠ擴增部分片段相似性在99.80%以上，這提示獲得的5株棘頭蟲均為同一種棘頭蟲。通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)物種序列用于Mega 7.0進化樹構(gòu)建，選取目的株JS-01通過NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫比對，與似矛球吻棘頭蟲(MG931943.1)相似性最高，為99.5%，與其他棘頭蟲蟲種Corynosomastrumosum(LC465399.1)、Andracanthaleucocarboi(MF527023.1)mtCOI相似性分別為74.3%和73.2%。根據(jù)分子種屬相似性可初步確定獲得的蟲株為似矛球吻棘頭蟲(圖4)。由圖5可知，JS-01～JS-05形成一獨立小分支，屬間樹枝間數(shù)值大小>50，可信度高，測序的JS株樣品序列與現(xiàn)有報道的似矛球吻棘頭蟲距離最近，在親緣關(guān)系上接近于似矛球吻棘頭蟲(MG931943.1)。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，顯示其為似矛球吻棘頭蟲。

A，組織壓片法觀察到的棘頭蟲；B，光學(xué)顯微鏡下觀察到的棘頭蟲吻部；C，光學(xué)顯微鏡下觀察到的棘頭蟲生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)A,Sphaerirostris lanceoides observed by tissue compression method;B,The head of Sphaerirostris lanceoides observed under optical microscope;C,The reproductive system structure of Sphaerirostris lanceoides observed under optical microscope圖2 棘頭蟲形態(tài)學(xué)觀察(40×)Fig.2 Morphological observation of the Sphaerirostris lanceoides (40×)

M,5K DNA Marker;1，陰性對照;2～6,分別為JS-01～JS-05M,5K DNA Marker;1，Negative control;2-6,JS-01 to JS-05,respectively圖3 COⅠ基因PCR擴增電泳圖Fig.3 PCR amplification electrophoresis of COⅠ gene

圖4 基于JS-01株棘頭蟲COⅠ基因的相似性比對Fig.4 Similarity comparison based on COⅠ gene from Sphaerirostris lanceoides JS-01 strain

圖5 基于棘頭蟲COⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on COⅠ gene of Sphaerirostris lanceoides

3 討 論

鳥類被認為是似矛球吻棘頭蟲的終末宿主，但該蟲體也有感染其他動物的報道[9]。Jing等[10]在2018年首次報道了似矛球吻棘頭蟲在兩棲動物腸道中的寄生案例，但未見多臟器感染案例的相關(guān)報道。本次臨床案例中對蟾蜍腸、肺臟、肝臟、胃、卵巢、脾臟等多個臟器進行剖檢分析，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致蟾蜍發(fā)生虛弱死亡的寄生蠕蟲為似矛球吻棘頭蟲，腸道和生殖腺等腺體是主要的寄生感染部位，推測全身性的感染寄生由消化道寄生蟲移行導(dǎo)致。組織病理學(xué)觀察顯示，似矛球吻棘頭蟲在蟾蜍體內(nèi)的寄生表現(xiàn)為機械性損傷、炎性癥狀等，對蟾蜍造成嚴重損傷，其中以肝臟機械性損傷、腸黏膜脫落、炎性增生為典型癥狀，與李春濤等[11]報道的黃鱔棘頭蟲感染的臨床病理變化相近，表明該類棘頭蟲的感染寄生能給蟾蜍造成嚴重病理損傷。

現(xiàn)有文獻表明，COⅠ基因具有較為廣泛的應(yīng)用，尤其在線蟲[12-15]、絳蟲[16-18]、吸蟲[19-20]、昆蟲[21]等分子生物學(xué)研究方面。本研究對感染蟾蜍優(yōu)勢蟲種mtDNA中的COI部分片段進行了擴增鑒定，發(fā)現(xiàn)與似矛球吻棘頭蟲相似性超過了99.0%，而與Corynosoma、Andracantha等屬相似性不足80.0%，在系統(tǒng)進化樹上形成明顯分支。在種內(nèi)相似性方面，測定的JS-01～JS-05多序列比對，種內(nèi)相似性則超過99.0%。似矛球吻棘頭蟲分子生物學(xué)方面的研究報道較少，本研究對COⅠ基因部分片段的擴增研究表明，COⅠ基因種內(nèi)變異小，種間差異性較大，能在似矛球吻棘頭蟲、Corynosomastrumosum、Andracanthaleucocarboi種屬間進行有效的區(qū)分。

棘頭蟲主要通過鼠婦等昆蟲作為中間宿主，因此野鳥、昆蟲等病原攜帶動物在養(yǎng)殖場的活動是圈養(yǎng)蟾蜍感染該類棘頭蟲的重要潛在途徑。筆者認為，可通過采取架設(shè)天網(wǎng)、使用顆粒料代替昆蟲等阻斷方式來減少圈養(yǎng)蟾蜍個體的感染風險。目前在兩棲動物寄生蟲治療方面研究報道較少，已知阿維菌素對虎紋蛙棘頭蟲的臨床驅(qū)蟲試驗具有較好的效果[22]，但也有報道發(fā)現(xiàn)伊維菌素類似成分阿維菌素等衍生化合物會對兩棲動物生存造成負面影響[23]，因此預(yù)防性驅(qū)蟲時應(yīng)在選藥、用量等方面予以重視。該例病蟾因感染似矛球吻棘頭蟲而發(fā)生死亡，在兩棲動物體內(nèi)多臟器感染寄生未見相關(guān)臨床案例和組織病理學(xué)研究，本研究結(jié)果可為藥用蟾蜍棘頭蟲病的防控提供臨床癥狀、病理、分子生物學(xué)等相關(guān)參考。

4 結(jié) 論

本研究報道了蟾蜍棘頭蟲的多臟器感染，病理學(xué)研究表明棘頭蟲的感染可能是造成宿主蟾蜍虛弱、死亡的重要原因；形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的研究表明該案例中的棘頭蟲是似矛球吻棘頭蟲。本研究結(jié)果對蟾蜍棘頭蟲病的診斷和防治具有重要的參考價值。