張 奇，肖會(huì)姣，武麗輝，賈 薇

1 北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094

2 中馭（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京 101102

3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125

0 引言

人類腸道內(nèi)存在上千種、數(shù)以億計(jì)的微生物，它們參與了人體多種物質(zhì)代謝，并與人體健康密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，疾病的發(fā)生通常伴隨著腸道微生態(tài)的改變，這越發(fā)引起了人們的關(guān)注。在某些因素致腸道微生態(tài)失衡的情況下，益生菌對(duì)肥胖[1]、糖尿病[2]、炎癥性腸病[3]、腫瘤[4]、動(dòng)脈粥樣硬化[5]、骨質(zhì)疏松[6]、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝及過(guò)敏反應(yīng)等的發(fā)生具有潛在地促進(jìn)作用[7]。

抗生素臨床治療感染性疾病時(shí)，對(duì)患者的腸道微生物有多種不良影響，如減少有益微生物的數(shù)量、促進(jìn)潛在致病菌的定植、刺激細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性、穩(wěn)定微生物抗藥性等[8]，進(jìn)而導(dǎo)致患者腸道菌群的組成和功能發(fā)生改變，從而影響健康。

我國(guó)益生菌資源豐富，尤其是牧民傳統(tǒng)自制乳制品，可作為益生菌的寶貴來(lái)源，探索新發(fā)現(xiàn)的源于自然發(fā)酵乳制品的益生菌的功能具有一定的意義。前期研究表明，驢乳具有顯著的腸道微生態(tài)調(diào)理功能，其作用可能與其富含益生菌有關(guān)。本研究首先對(duì)從新疆驢乳發(fā)酵乳中篩選的菌種L28進(jìn)行鑒定，然后以抗生素致小鼠腸道菌群失調(diào)模型為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以L28為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，低聚果糖為陽(yáng)性對(duì)照物，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定干預(yù)前后腸道內(nèi)腸桿菌、乳酸菌的含量和比例變化，并通過(guò)16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，分析干預(yù)前后模型動(dòng)物腸道菌群的多樣性，確證植物乳桿菌L28對(duì)腸道調(diào)理的益生功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SPF級(jí)KM小鼠25 只，雄性，體重18～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2016-0011）；鹽酸林可霉素（貨號(hào)：L8390）、頭孢唑啉鈉（貨號(hào)：C9680）、氨芐西林鈉（貨號(hào)：A8180）、低聚果糖（貨號(hào)：F8370），購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；MC、MRS、VABR培養(yǎng)基，購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；菌種L28，從新疆牧民自制傳統(tǒng)驢乳發(fā)酵乳中篩選獲得，產(chǎn)酸、接觸酶陰性、革蘭氏染色陽(yáng)性、桿狀；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 L28的培養(yǎng)

取保存的L28菌種，MRS平板活化，挑取單菌落，MRS肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液離心去上清，PBS（0.02 mol/L，pH7.4）洗滌菌體2 次，然后將菌體分散于PBS中，配制濃度分別為1.0×105CFU/mL和1.0×109CFU/mL的菌液。

1.2.2 L28菌種鑒定

將上述菌種培養(yǎng)物進(jìn)行碳水化合物鑒定（API50CH）。同時(shí)對(duì)其16S rDNA和pheS基因進(jìn)行測(cè)序、分析、比對(duì)。

1.2.3 腸道菌群失調(diào)動(dòng)物模型的建立

隨機(jī)選取20 只KM小鼠，無(wú)菌條件下采集糞便，隨后灌服抗生素溶液（以無(wú)菌生理鹽水配制的鹽酸林可霉素、頭孢唑啉鈉及氨芐西林鈉的混合液，3 種抗生素的終濃度均為20 mg/mL，0.2 mL/只，每天2 次，連續(xù)3 天，然后收集灌胃小鼠糞便，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)乳酸菌和腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，以乳酸菌菌落數(shù)顯著降低且降低程度高于腸桿菌為模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2.4 分組及干預(yù)

將抗生素處理過(guò)的20 只小鼠隨機(jī)分為4 組，每組5 只：A組（模型自然恢復(fù)組，以PBS灌胃）、B組（L28低劑量組，1.0×105CFU/mL）、C組（L28高劑量組，1.0×109CFU/mL），D組（低聚果糖陽(yáng)性對(duì)照組，100 mg/mL的低聚果糖生理鹽水溶液），0.2 mL/只，每天2 次，連續(xù)6 天；未經(jīng)抗生素處理的5 只小鼠作為空白對(duì)照組（E組）。

1.2.5 糞便采集及微生物計(jì)數(shù)

于灌胃前（第0天）、灌胃3 天后（第3天）和灌胃6 天后（第6天）無(wú)菌采集小鼠糞便，經(jīng)稀釋后選擇適當(dāng)?shù)南♂尪?，分別涂布MC和VRBA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù).

1.2.6 微生物多樣性分析

為了進(jìn)一步證明L28對(duì)小鼠腸道紊亂模型腸道微生態(tài)的改善作用，在無(wú)菌條件下收集模型自然恢復(fù)組、空白對(duì)照組、低聚果糖陽(yáng)性對(duì)照組以及高、低濃度L28干預(yù)組6 天后的實(shí)驗(yàn)小鼠糞便，委托北京博云華康基因科技有限公司對(duì)糞便中的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行微生物菌群多樣性分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法

以Excel對(duì)各組動(dòng)物腸道菌群進(jìn)行分析，計(jì)算x±s，比較各組之間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

將L28菌接種于37 ℃培養(yǎng)后，進(jìn)行碳水化合物利用研究（表1）；同時(shí)，進(jìn)行16S rDNA和pheS基因測(cè)序，基因序列見(jiàn)表2，經(jīng)序列同源性比對(duì)，結(jié)果表明，L28菌株與Lactobacillus plantarumWCFS1（Sequence ID： NC_004567.2）的同源性達(dá)99%，結(jié)合理化性質(zhì)、碳水化合物利用，對(duì)比伯杰氏手冊(cè)，綜合鑒定菌株L28為植物乳桿菌。

表1 菌種L28 碳源利用鑒定

2.2 動(dòng)物模型構(gòu)建

無(wú)菌條件下收集20 只小鼠抗生素灌胃前后的糞便，以平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)灌胃前后糞便中的乳酸菌和腸桿菌的變化，經(jīng)抗生素灌胃后，小鼠腸道中乳酸菌與腸桿菌含量均顯著降低（p＜0.01），且抗生素灌胃小鼠糞便中乳酸菌含量降低更多，降低比例顯著高于腸桿菌，根據(jù)模型判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷模型建立成功（表3）。

表3 腸道紊亂模型構(gòu)建（x±s，log CFU/g，n=20）

2.3 益生菌對(duì)腸道微生態(tài)干預(yù)

分別對(duì)0 d、3 d和6 d各組動(dòng)物腸道內(nèi)乳酸菌和腸桿菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1，不同劑量乳桿菌灌胃組（B、C）及陽(yáng)性對(duì)照組（D）與模型自然恢復(fù)組（A）相比，3 d和6 d時(shí)腸道中的乳酸菌和腸桿菌均有顯著提升，與干預(yù)時(shí)間正相關(guān)（p＜0.01），6 d時(shí)，高劑量植物乳桿菌L28干預(yù)組的小鼠腸道內(nèi)乳酸菌恢復(fù)更快，含量可達(dá)正常空白對(duì)照組水平，與之相比無(wú)顯著差異（p＞0.05），且存在劑量依賴關(guān)系。

圖1 植物乳桿菌L28對(duì)腸道內(nèi)乳酸菌和腸桿菌的影響

2.4 16S rDNA測(cè)序分析

收集模型自然恢復(fù)組、低、高濃度植物乳桿菌L28組、陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組6 d后的小鼠糞便，測(cè)序分析其腸道微生物多樣性，組間Alpha多樣性如圖2所示，經(jīng)L28和低聚果糖干預(yù)后，observed species、Chao、ACE以及Shannon 指數(shù)提高，Simpson 指數(shù)下降，表明小鼠腸道菌群多樣性顯著提升，植物乳桿菌L28具備顯著的改善腸道微生態(tài)功能。

圖2 組間Alpha多樣性盒形圖

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇致腸道紊亂的抗生素種類[9]，同時(shí)調(diào)整抗生素終濃度至20 mg/mL，灌胃KM小鼠，建立腸道菌群紊亂小鼠模型，經(jīng)檢測(cè)，灌胃抗生素小鼠糞便中腸桿菌與乳酸菌均由1.0×108CFU/g降至約1.0×104CFU/g，且乳酸菌下降更多，含量低于腸桿菌，適合于腸道微生態(tài)干預(yù)恢復(fù)研究。

腸道微生態(tài)與人體健康密切相關(guān)，在某些因素致腸道微生態(tài)失衡的情況下，可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生或提升患病風(fēng)險(xiǎn)[7]?？股刂委煂?duì)宿主腸道微生物有諸多不良影響，如減少有益微生物的數(shù)量、促進(jìn)潛在致病菌的定植、刺激和穩(wěn)定細(xì)菌對(duì)抗生素的抗藥性等[8]。因此，抗生素使用后，采用益生菌制劑加速腸道微生態(tài)恢復(fù)對(duì)于機(jī)體健康而言具有重要意義。

本研究對(duì)從新疆牧民傳統(tǒng)自制驢乳發(fā)酵乳中篩選獲得的潛在菌種L28進(jìn)行菌種鑒定，確認(rèn)其分類地位為植物乳桿菌——國(guó)家衛(wèi)健委可食用菌種目錄之一。隨后采用抗生素致小鼠腸道紊亂模型，在腸道菌群被破壞的情況下灌服L28，3 d后腸道內(nèi)乳酸菌顯著恢復(fù)，6 d恢復(fù)至正常水平。為了證明模型小鼠腸道內(nèi)乳酸菌恢復(fù)為腸道功能恢復(fù)，不是因植物乳桿菌L28灌服提升了乳酸菌總體含量，進(jìn)一步采用16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)各組小鼠的腸道菌群多樣性進(jìn)行分析，綜合比較observed species、Chao、ACE、Shannon及Simpson 指數(shù)變化，結(jié)果顯示干預(yù)后小鼠腸道菌群多樣性顯著提升，L28菌株具備顯著的改善抗生素致腸道紊亂小鼠模型的腸道微生態(tài)。