吳靈丹，陳 潔，王資懿，徐柒華

0引言

外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(traumatic proliferative vitreoretinopathy，TPVR)是開放性眼外傷的一種常見并發(fā)癥，其本質(zhì)是過度的眼內(nèi)創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)，在視網(wǎng)膜前后形成具有收縮能力的纖維膜，最終牽拉視網(wǎng)膜造成視網(wǎng)膜脫離，目前臨床上無有效的抑制方法。手術(shù)可以去除增生的組織，但是不能抑制細胞增殖，導(dǎo)致治療后復(fù)發(fā)率高[1-2]。目前臨床和基礎(chǔ)研究中已有多種藥物被用于治療TPVR，如皮質(zhì)類固醇、抗代謝類藥物、維生素、中藥提取物等。曲安奈德(triamcinolone acetonide，TA)作為臨床上抑制TPVR發(fā)展的藥物已得到廣泛認可，但臨床使用中發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射TA后容易導(dǎo)致眼壓升高及白內(nèi)障等不良反應(yīng)[3]。最新研究表明中藥提取物青蒿琥酯(artesunate，ART)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗增殖作用[4-7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素(luteolin，LU)與一些免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用有關(guān)，可抑制炎性細胞活化、炎癥介質(zhì)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生成[8]，其在眼科具有抗氧化，保護視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞及抗腫瘤作用[9-10]，可作為治療眼部疾病的一種潛在選擇。尋找能夠有效防治TPVR且對眼部毒性作用較小的藥物尤為重要，因此本研究主要觀察上述三種藥物在防治TPVR中的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康成年青紫藍兔48只，6～8周齡，體質(zhì)量2.0～2.5kg，飼養(yǎng)環(huán)境室溫10℃～25℃，濕度50%～75%。實驗前均行雙眼裂隙燈及直接檢眼鏡檢查，保證雙眼無眼部疾病。本研究經(jīng)南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審核批準(zhǔn)(審批號：YLP202103005)。

1.1.2主要試劑和儀器曲安奈德1mg/mL(H20033525，浙江仙琚制藥股份有限公司)，木犀草素10μg/mL(MUST-18102605，成都曼特斯生物科技有限公司)，青蒿琥酯20μg/mL(418A024，北京索萊寶科技有限公司)，鹽酸丙美卡因滴眼液(愛爾康有限公司)，加替沙星眼用凝膠(沈陽興齊眼藥股份有限公司)，左氧氟沙星滴眼液(萬漢制藥有限公司)，氟米龍滴眼液(參天制藥有限公司)，蛋白酶抑制劑(士德生物工程有限公司)，PBS(美國Hyclone公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，SDS裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，蛋白酶抑制劑混合物(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)，波形蛋白(vimentin，VIM)(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)，GAPDH(諾倫生物科技有限公司)，二抗Goat Anti-Rabbit IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，PVDF膜(美國Promega公司)，免疫印跡檢測試劑盒(美國Advan-sta公司)，眼球固定液(G1109，Servicebio)。眼底照相機(尼德克醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司)，眼部B超機(德國Aviso公司)。

1.2方法

1.2.1富含血小板的血漿制備以注射器抽取兔耳動脈血5mL注入含3.8%枸櫞酸鈉的玻璃離心管(血與枸櫞酸鈉體積比9∶1)，輕輕搖動混勻，室溫離心10min(1500r/min)，取1/3體積上清液，進行血小板計數(shù)，獲得血小板密度(1.9～2.8)×108/mL的血漿[11]。

1.2.2TPVR動物模型制作及分組將48只青紫藍兔隨機分為對照組、TA組、ART組、LU組，每組12只，均以右眼為實驗眼。術(shù)前3d，術(shù)眼滴左氧氟沙星滴眼液，每天4次。用鹽酸丙美卡因滴眼液進行表面麻醉，開瞼器開瞼，聚維酮碘注射液沖洗術(shù)眼結(jié)膜囊，采用15度刀刺向玻璃體中心部，造成長約3mm的鞏膜穿通傷，抽吸0.3mL玻璃體液后注入等量富含血小板的血漿，隨后對照組玻璃體腔內(nèi)注射0.1mL生理鹽水，TA組玻璃體腔內(nèi)注射0.1mL(1mg/mL)曲安奈德，ART組玻璃體腔內(nèi)注射0.1mL(20μg/mL)青蒿琥酯，LU組玻璃體腔內(nèi)注射0.1mL(10μg/mL)木犀草素。玻璃體腔注藥后1wk內(nèi)，給予左氧氟沙星滴眼液及氟米龍滴眼液預(yù)防感染。本研究藥物注射濃度參考既往文獻[8，12-13]中的實驗數(shù)據(jù)。

1.2.3玻璃體及視網(wǎng)膜觀察術(shù)后1、2、3、4wk，復(fù)方托吡卡胺散瞳后，通過眼底照相、眼部B超觀察并記錄各組兔眼玻璃體及視網(wǎng)膜改變情況。TPVR分級評定標(biāo)準(zhǔn)[14]：(1)0級：玻璃體基本透明，未見明顯異常；(2)1級：玻璃體內(nèi)形成增生條索，未見牽引；(3)2級：視網(wǎng)膜前可見膜狀物形成，可見局部牽引，未見視網(wǎng)膜脫離；(4)3級：后極部視網(wǎng)膜可見褶皺，可有局部視網(wǎng)膜脫離；(5)4級：大范圍視網(wǎng)膜脫離(包括后極部、周圍視網(wǎng)膜脫離)；(6)5級：視網(wǎng)膜皺縮，增生條索牽拉視網(wǎng)膜脫離，可見裂孔。

1.2.4WesternBlot法檢測玻璃體液中α-SMA及VIM蛋白表達水平術(shù)后28d，各組隨機選取動物4只。于角膜緣后4mm處不同鐘點位用7號針頭抽取玻璃體液0.5mL，加入蛋白酶抑制劑，12000r/min離心15min，收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。等量蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶在TBST中室溫封膜1h，并與α-SMA、VIM、GAPDH一抗混合后4℃孵育過夜；相應(yīng)二抗室溫下孵育1h；滴加ECL發(fā)光液，成像系統(tǒng)顯影后使用Image J成像軟件分析檢測結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.2.5視網(wǎng)膜組織HE染色術(shù)后28d，各組動物經(jīng)心內(nèi)注射麻醉劑“安樂死”，立即摘除右眼眼球，置于FSA眼球固定液固定，梯度蔗糖溶液脫水，OCT包埋、冰凍、切片、HE染色，顯微鏡觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

2.1玻璃體及視網(wǎng)膜改變情況術(shù)后28d，四組間TPVR分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=18.85，P<0.001，表1)，TA組、LU組、ART組分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TA組分別與ART組、LU組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明TA、ART、LU均能有效抑制TPVR的發(fā)生。眼底照相及眼部B超結(jié)果顯示，對照組可見視網(wǎng)膜前增殖膜及視網(wǎng)膜脫離；LU組玻璃體混濁，視網(wǎng)膜前膜狀物形成，局部牽引；ART組玻璃體內(nèi)增生條索，未出現(xiàn)牽拉性視網(wǎng)膜脫離；TA組未見增殖膜及視網(wǎng)膜脫離，僅出現(xiàn)玻璃體混濁(圖1～2)。

表1 術(shù)后28d各組TPVR分級情況 眼

圖1 眼底照相 A：術(shù)前正常兔眼眼底圖像；B、C：術(shù)后28d對照組兔眼視網(wǎng)膜脫離及增殖膜形成；D：術(shù)后28d LU組兔眼視網(wǎng)膜前膜狀物，髓線抬高；E：術(shù)后28d ART組兔眼玻璃體混濁，可見增生條索；F：術(shù)后28d TA組兔眼未見增殖膜，僅出現(xiàn)玻璃體混濁。

圖2 眼部B超 A：術(shù)前正常兔眼部B超；B：術(shù)后28d對照組兔眼玻璃體混濁伴視網(wǎng)膜漏斗狀脫離；C：術(shù)后28d LU組兔眼玻璃體混濁伴后脫離；D：術(shù)后28d ART組兔眼玻璃體混濁伴輕微后脫離；E：術(shù)后28d TA組兔眼玻璃體輕度混濁。

2.2玻璃體液中α-SMA及VIM蛋白表達水平Western Blot結(jié)果顯示，術(shù)后28d四組兔眼玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表2，圖3)。TA組、LU組和ART組玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平均低于對照組，LU組和ART組玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平均高于TA組，ART組玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平均低于LU組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組玻璃體液α-SMA及VIM蛋白水平比較

圖3 各組玻璃體液中α-SMA、VIM蛋白表達水平 A：Western Blot檢測結(jié)果；B：四組玻璃體液α-SMA蛋白表達水平比較；C：四組玻璃體液VIM蛋白表達水平比較。bP<0.01 vs 對照組；dP<0.01 vs TA組；fP<0.01 vs ART組。

2.3視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果術(shù)后28d，對照組兔眼視網(wǎng)膜各層排列紊亂，嚴(yán)重扭曲或局部斷裂，各層結(jié)構(gòu)不清晰，前膜明顯增厚，視網(wǎng)膜明顯脫離；LU組兔眼視網(wǎng)膜各層排列輕微扭曲，視網(wǎng)膜前可見炎性滲出，視網(wǎng)膜淺層脫離；ART組兔眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，輕度水腫，可見淺層脫離；TA組兔眼視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列尚整齊，局部可見視網(wǎng)膜褶皺，無視網(wǎng)膜脫離(圖4)。

圖4 術(shù)后28d視網(wǎng)膜病理變化 A：對照組結(jié)構(gòu)紊亂，嚴(yán)重扭曲，視網(wǎng)膜脫離；B：TA組結(jié)構(gòu)基本整齊正常，視網(wǎng)膜水腫；C：LU組視網(wǎng)膜前炎性滲出及視網(wǎng)膜淺層脫離；D：ART組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，輕度水腫，視網(wǎng)膜淺層脫離。

3討論

TPVR的形成過程是復(fù)雜的循環(huán)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是由多種因子及細胞作用的結(jié)果。眼外傷導(dǎo)致玻璃體和視網(wǎng)膜破裂，使得RPE細胞從Bruch膜中脫離。RPE作為TPVR的主要參與者，RPE細胞經(jīng)歷了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程，同時巨噬細胞、成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等遷入，并在各種細胞因子、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、VEGF等作用下產(chǎn)生間充質(zhì)細胞等生物學(xué)效應(yīng)，形成具有收縮作用的前膜，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離[15-17]。本研究顯示，TA、ART、LU均能通過抑制玻璃體液中α-SMA及VIM表達顯著抑制玻璃體視網(wǎng)膜增生，表明TA、ART、LU均可有效抑制TPVR的發(fā)生發(fā)展，由此推測上述藥物均參與延緩EMT進程，有望成為治療TPVR的新方法。

既往研究表明玻璃體腔注射TA可以明顯減少增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的發(fā)生[12]。TA可降低細胞免疫反應(yīng)，對血-視網(wǎng)膜屏障起穩(wěn)定作用，減輕炎癥，抑制磷脂酶、前列腺素、白三烯等炎癥因子的生成或釋放，阻止炎癥細胞移行[18]，且可抑制成纖維細胞分化、色素上皮細胞增殖、巨噬細胞和肥大細胞移行，具有抗增殖和抑制瘢痕形成的作用。α-SMA及VIM作為間充質(zhì)細胞的間質(zhì)標(biāo)志物，已經(jīng)被證實在PVR的形成過程中表達增加[19-20]。研究表明，諸多藥物能夠通過降低α-SMA及VIM的表達水平抑制RPE細胞的增殖，從而阻斷EMT過程，能夠顯著緩解PVR的發(fā)生。白藜蘆醇通過抑制SAMD4通路抑制經(jīng)TGF-β2誘導(dǎo)的RPE細胞的EMT過程，且能降低α-SMA的表達，表明其能抑制TPVR的發(fā)生發(fā)展[21]；姜黃素可通過多種途徑抑制RPE細胞的增殖和EMT過程[22]；藏紅花素通過抑制p38的磷酸化降低VIM和α-SMA的表達，表明其能夠有效抑制RPE細胞增殖、遷移和TGF-β2誘導(dǎo)的EMT過程[23]。上述中藥提取物均可以通過抑制不同的信號通路抑制RPE細胞的增殖和遷移。

本研究發(fā)現(xiàn)，三組注藥組玻璃體液中α-SMA及VIM蛋白含量均低于對照組，表明TA、ART、LU可能參與調(diào)控RPE細胞的EMT過程，抑制TPVR的產(chǎn)生。此外，玻璃體腔注射TA術(shù)后28d眼部B超顯示僅有玻璃體輕度混濁；眼底圖像未見增殖膜；TPVR分級明顯低于對照組；病理切片顯示視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列尚整齊，僅出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫，表明TA可以抑制TPVR前膜的發(fā)生以及降低玻璃體液中α-SMA及VIM的表達，且效果優(yōu)于ART和LU，提示TA對EMT過程具有更強的調(diào)控作用，這與王兆艷等[24]報道相似。但是，由于TA在臨床中具有較多的不良反應(yīng)報道，不利于其廣泛應(yīng)用。為尋更優(yōu)于TA的藥物，本研究選擇ART和LU進行研究，ART和LU雖未見于在TPVR臨床治療中的應(yīng)用，但本研究發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射ART及LU術(shù)后28d眼部B超及眼底圖像顯示玻璃體混濁，出現(xiàn)玻璃體增生條索及膜性物質(zhì)；TPVR分級低于對照組；病理切片結(jié)構(gòu)也較對照組清晰，提示ART和LU也能在一定程度上抑制α-SMA及VIM的表達，且顯著抑制TPVR癥狀。近期也有研究證明，ART能夠通過Smad3信號通路抑制ARPE-19細胞的增殖和收縮，從而抑制α-SMA及VIM的表達[25]，這與本研究結(jié)果相符。另有研究表明ART能抑制眼內(nèi)新生血管[26-27]，抑制人卵巢癌細胞增殖以及通過抑制TGF-β1介導(dǎo)的肺泡上皮NF-κB及成纖維細胞的信號通路Jagged1、Notch1，從而抑制α-SMA及膠原的表達[28]。LU可通過抑制炎癥標(biāo)志物的表達和釋放減輕眼部炎癥，且與皮質(zhì)類固醇抗炎效果相當(dāng)[29]，且有學(xué)者證實LU可以保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及RPE細胞[29-31]。李茜等[32]研究發(fā)現(xiàn)LU可以通過抑制大鼠NF-κB信號通路減輕視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激及炎癥損傷，而Jagged1、Notch1、NF-κB信號通路也參與TGF-β2介導(dǎo)的RPE細胞EMT過程。故推測ART、LU能通過抑制多種信號通路進一步抑制TPVR的產(chǎn)生，其在TPVR治療中具有極大的潛在應(yīng)用價值，但具體作用機制有待于進一步探索，未來研究中可以通過深入研究ART及LU對RPE細胞的作用揭示其抗TPVR發(fā)生的機制。

綜上，玻璃體腔內(nèi)注射TA、LU及ART均對TPVR具有抑制作用，其中TA效果最明顯。ART和LU是潛在的有效藥物，但是作用機制尚不明確，后期可通過研究具體的作用機制為開發(fā)抗增殖效果明顯且毒副作用小的TPVR防治藥物奠定基礎(chǔ)。