胡可可，杜紅俊，惠延年

0引言

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitroretinopathy，PVR)是在孔源性視網(wǎng)膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment，RRD)自然病程中、視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)及嚴(yán)重眼球外傷后，由于玻璃體內(nèi)和視網(wǎng)膜表面廣泛的纖維增生以及膜收縮，最終形成牽拉性視網(wǎng)膜脫離，而非新生血管化的致盲性眼病[1]。PVR嚴(yán)重影響患者視功能的恢復(fù)以及手術(shù)治療預(yù)后。

由于缺乏有效的治療藥物，玻璃體切除術(shù)目前仍是治療PVR的主要方法。雖然隨著玻璃體切除手術(shù)技術(shù)不斷進(jìn)步，術(shù)后視網(wǎng)膜復(fù)位率大大提高，但手術(shù)仍然存在玻璃體切除不完全、增殖膜剝離不徹底、眼內(nèi)填充物刺激、術(shù)后炎癥反應(yīng)以及PVR復(fù)發(fā)等問題，最終造成手術(shù)失敗，因此仍有5%～10%的患者術(shù)后會(huì)再次發(fā)生PVR[2]。加深對(duì)PVR發(fā)病機(jī)制中重要途徑的闡明和對(duì)其病理學(xué)的理解，有助于尋找預(yù)防或治療PVR的藥物。

既往研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在其中發(fā)揮重要作用[3]，本文將就VEGF及EMT在PVR發(fā)病機(jī)制中的作用及二者的聯(lián)動(dòng)關(guān)系進(jìn)行概述，以期為研發(fā)PVR的治療藥物提供思路。

1 PVR發(fā)病機(jī)制

在發(fā)生RRD時(shí)，視網(wǎng)膜裂孔的出現(xiàn)使得RPE細(xì)胞播散至玻璃體腔，增生的細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成增生膜附著于視網(wǎng)膜表面并產(chǎn)生牽拉，最終影響視網(wǎng)膜脫離的手術(shù)成功率或?qū)е乱暰W(wǎng)膜脫離復(fù)發(fā)。從病理機(jī)制方面，PVR包括了缺血期、炎癥期、細(xì)胞凋亡期、細(xì)胞遷移增殖期和瘢痕收縮期五個(gè)階段[4]。而從組織形態(tài)學(xué)方面，PVR的發(fā)病過(guò)程包括RPE細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞遷移、遷移細(xì)胞的增殖、增殖膜形成、增殖膜收縮、細(xì)胞外膠原蛋白形成和視網(wǎng)膜上形成固定皺褶六個(gè)步驟[3]。以上變化導(dǎo)致了PVR患者的視功能改變及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損害。

已經(jīng)證明，PVR是一個(gè)由諸多細(xì)胞及細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果。涉及的細(xì)胞主要包括RPE細(xì)胞、視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。細(xì)胞因子主要包括干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)等炎癥因子及VEGF、血小板衍生因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)等生長(zhǎng)因子[5]。這些因子通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞遷移、增殖、EMT和ECM的合成參與PVR的發(fā)生。其中，VEGF及RPE細(xì)胞的EMT被認(rèn)為起著核心作用[6-7]。

2 VEGF在PVR發(fā)病中的作用及機(jī)制

2.1VEGF及其主要作用VEGF是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞高度特異性的有絲分裂因子，廣泛分布于人和動(dòng)物的腦、腎、肝和眼等多種組織中。VEGF在眼內(nèi)RPE細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、Müller細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等均可表達(dá)。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PLGF)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，VEGF主要通過(guò)增加血管通透性和誘發(fā)新生血管形成而參與視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)等新生血管相關(guān)疾病的發(fā)生和進(jìn)展[8]。

2.2VEGF參與PVR的發(fā)生近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，除視網(wǎng)膜血管病外，VEGF還參與PVR的發(fā)生和發(fā)展，且與PVR嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5]。Ricker等[9]檢測(cè)了RRD患眼視網(wǎng)膜下液VEGF含量，發(fā)現(xiàn)伴PVR的患眼為不伴PVR的患眼的2～3倍。Ni等[7]檢測(cè)了24例PVR患眼的玻璃體，同樣證實(shí)了VEGF表達(dá)水平增高。

2.2.1VEGF通過(guò)促進(jìn)RPE細(xì)胞增生和遷移而促進(jìn)PVR VEGF通過(guò)與其特異性受體(VEGF receptor，VEGFR)發(fā)生特異性、高親和力結(jié)合后形成二聚體而發(fā)揮其直接作用。VEGFR主要包括兩個(gè)酪氨酸激酶受體，即flt-1和flk-1/KDR。RPE細(xì)胞被證實(shí)可同時(shí)表達(dá)這兩種受體，因此可在VEGF誘導(dǎo)下發(fā)生增生或遷移，從而導(dǎo)致PVR的發(fā)生或加快其進(jìn)展[10]。

2.2.2VEGF通過(guò)PDGF信號(hào)通路促進(jìn)PVR的發(fā)生除直接作用外，VEGF主要通過(guò)PDGF信號(hào)通路間接促進(jìn)PVR的發(fā)生。VEGF與PDGF是密切相關(guān)的超家族信號(hào)傳導(dǎo)的成員，擁有8個(gè)半胱氨酸殘基的同源序列。PDGF家族包括PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D四個(gè)成員，通過(guò)二硫鍵形成同源或異源二聚體。PDGF受體(PDGF receptor，PDGFR)具有高度特異性，包括PDGFR-α和PDGFR-β兩種亞型。PDGFR-α除了可以被PDGF直接激活，也可以被非PDGF因子(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1等)間接激活。

研究發(fā)現(xiàn)，PVR患眼內(nèi)PDGF大量表達(dá)，且與PVR嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5, 11]。細(xì)胞表面的PDGFR-α被PDGF-C激活后發(fā)生二聚化，進(jìn)一步激活磷脂酰肌醇3激酶(P13K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白(Akt)通路及其下游的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增生和遷移。隨后PDGFR-α被快速內(nèi)在化和降解，其激活的信號(hào)通路也隨即失去作用。非PDGF因子與PDGFR-α結(jié)合后，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成和激活Src-家族酪氨酸激酶(SFK)，間接激活其下游通路[12-13]，進(jìn)而活化下游的鼠雙微體基因2(murine double minute 2，Mdm2)蛋白，抑制p53基因的表達(dá)，從而促進(jìn)PVR早期細(xì)胞的存活和增殖[14]。VEGF參與PVR的機(jī)制主要在于通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗PDGF與PDGFR-α結(jié)合，阻止PDGFR-α的二聚化，延長(zhǎng)PDGFR-α在細(xì)胞表面存留時(shí)間，從而增加非PDGF因子促進(jìn)RPE細(xì)胞存活和增殖的作用[14]。

3 EMT在PVR發(fā)病中的作用及機(jī)制

EMT是指上皮細(xì)胞在一定條件下失去其上皮表型，轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程。EMT可介導(dǎo)胚胎發(fā)育、器官生成及傷口愈合等生理過(guò)程，同時(shí)也參與組織纖維化、癌癥轉(zhuǎn)移或PVR等病理生理過(guò)程[15]。

RPE細(xì)胞是PVR發(fā)生發(fā)展中最重要的細(xì)胞成分。在發(fā)生RRD時(shí)，RPE細(xì)胞與Bruch膜分離，并通過(guò)視網(wǎng)膜裂孔播散至玻璃體腔中。同時(shí)，由于血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，玻璃體腔內(nèi)細(xì)胞因子含量和活性增加。這些因素的共同作用促使RPE細(xì)胞啟動(dòng)EMT[16-17]。

3.1EMT中RPE細(xì)胞特性的變化在生理?xiàng)l件下，RPE細(xì)胞是一種典型的“鵝卵石”樣上皮外觀形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)含有大量黑色素顆粒。細(xì)胞之間依靠緊密連接保持靜止?fàn)顟B(tài)，維持特有的形態(tài)和功能。在EMT過(guò)程中，RPE細(xì)胞內(nèi)閉合小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)表達(dá)減少，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白及纖維連接蛋白等表達(dá)增加。由于α-SMA是細(xì)胞移行和收縮功能的基礎(chǔ)，其表達(dá)水平增加被認(rèn)為是EMT的關(guān)鍵標(biāo)志[18]。發(fā)生EMT的細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞極性丟失、增殖和遷移能力增加，最終轉(zhuǎn)分化為具有收縮能力的成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，并獲得高度侵襲移行能力、抗凋亡能力及分泌大量ECM的能力，從而導(dǎo)致PVR的發(fā)生和發(fā)展[3]。

3.2參與EMT的細(xì)胞因子及信號(hào)通路多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路參與了PVR中的EMT的發(fā)生：細(xì)胞因子主要包括TGF-β、PDGF及CTGF等，信號(hào)通路主要包括Smad、Notch和Wnt/β-catenin等[19]。

3.2.1TGF-β促進(jìn)EMT和PVR發(fā)生TGF-β是一種強(qiáng)效EMT趨化因子，在各種纖維化相關(guān)疾病中扮演著至關(guān)重要的角色，其作用貫穿了RPE細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、黏附以及纖維增殖膜的收縮。在TGF-β刺激下，RPE細(xì)胞還顯示了部分EMT改變，包括上皮細(xì)胞標(biāo)志物下調(diào)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物上調(diào)和遷移能力增強(qiáng)。研究表明，在PVR患者和PVR動(dòng)物模型中，TGF-β在玻璃體和視網(wǎng)膜前膜中表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且與PVR的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這些結(jié)果提示TGF-β在RPE細(xì)胞的EMT過(guò)程中起著重要作用[20]。

關(guān)于其機(jī)制，目前證實(shí)TGF-β主要通過(guò)激活Smad信號(hào)通路和非Smad信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)EMT。TGF-β與跨膜的TGF-βⅡ型受體(TGFR2)結(jié)合，隨后與TGF-βⅠ型受體(TGFR1)結(jié)合，形成緊密連接復(fù)合體，誘導(dǎo)Smad2和Smad3磷酸化，并與共同調(diào)質(zhì)Smad4結(jié)合形成三聚體，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，通過(guò)與調(diào)控基因序列上的特定順式作用元件相互作用來(lái)調(diào)控TGF-β反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[21]。

此外，多種非Smad信號(hào)通路也被證實(shí)參與了TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程，包括p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)MAPK、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶-1(TGF-β activated kinase-1，TAK1)及Jagged/Notch等信號(hào)通路。p38 MAPK的激活可促進(jìn)Ⅰ型膠原生成增加，ERK1/2 MAPK的激活可促進(jìn)α-SMA、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)，ERK1/2 MAPK信號(hào)通路還可以與TGF-β/Smad及Jagged/Notch信號(hào)通路產(chǎn)生交叉作用[22]。

3.2.2PDGF及PDGF信號(hào)通路與EMT 多項(xiàng)研究表明，PDGF-BB二聚體可通過(guò)與PDGFR-β結(jié)合后上調(diào)α-SMA和Ⅰ型膠原，下調(diào)RPE細(xì)胞中的ZO-1表達(dá)，激活ERK1/2 MAPK、P38 MAPK等信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)RPE細(xì)胞的增殖和遷移[23]。PDGF信號(hào)通路還可通過(guò)非PDGF因子介導(dǎo)的PDGFR-α激活途徑，促進(jìn)RPE細(xì)胞的增生、活化、遷移，從而使存活的RPE細(xì)胞對(duì)TGF-β作出反應(yīng)，轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。

3.2.3CTGF促進(jìn)RPE細(xì)胞EMT CTGF是一種分泌蛋白，廣泛分布于人體的各組織器官，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及分化，并已成為病理性纖維化的治療靶點(diǎn)[24]。在眼內(nèi)，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞是產(chǎn)生CTGF的主要來(lái)源。CTGF可調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子和ECM蛋白的活性，參與ECM合成、重塑、傷口愈合及纖維化。玻璃體腔內(nèi)注射CTGF可誘導(dǎo)兔PVR模型。CTGF作為TGF-β的下游效應(yīng)介質(zhì)，可通過(guò)增強(qiáng)TGF-β與TGFR2的結(jié)合，促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的纖維黏連蛋白EDA片段(fibronectin-EDA，EDA-FN)表達(dá)，后者進(jìn)一步介導(dǎo)了RPE細(xì)胞EMT發(fā)生[25]。

4 VEGF與EMT的聯(lián)動(dòng)關(guān)系

現(xiàn)已明確，在組織損傷中，EMT參與并導(dǎo)致了組織纖維化[15]。視網(wǎng)膜下纖維化為復(fù)雜的病理改變，是組織對(duì)于慢性損傷的病理應(yīng)答，分為血管新生、肉芽組織形成及結(jié)締組織重塑三個(gè)階段[26]。VEGF主要通過(guò)兩個(gè)途徑參與纖維化過(guò)程：(1)VEGF和CTGF之間的平衡決定著纖維化的進(jìn)程。在眼內(nèi)的損傷修復(fù)過(guò)程中，VEGF和CTGF之間存在某種平衡。Inoki等[27]在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)VEGF能上調(diào)CTGF的表達(dá)，二者通過(guò)形成VEGF-CTGF復(fù)合體使VEGF失活，并且當(dāng)這兩種因子比率達(dá)到某一閾值時(shí)發(fā)生血管纖維化轉(zhuǎn)變，此時(shí)由過(guò)量CTGF驅(qū)動(dòng)的纖維化可導(dǎo)致視網(wǎng)膜瘢痕形成[28]，目前引起血管新生向血管纖維化的開關(guān)尚不明確。(2)VEGF通過(guò)PDGF通路參與纖維化：VEGF可競(jìng)爭(zhēng)性拮抗PDGF與PDGF受體α(PDGFRα)結(jié)合，或通過(guò)促進(jìn)非PDGF因子介導(dǎo)的PDGFRα間接激活途徑促進(jìn)EMT的發(fā)生，從而導(dǎo)致了視網(wǎng)膜下纖維化。針對(duì)VEGF與EMT聯(lián)動(dòng)關(guān)系中關(guān)鍵分子和詳細(xì)機(jī)制的研究，可為PVR的治療提供了新的思路和方法。

5抗VEGF治療對(duì)PVR的防治作用

鑒于VEGF以上的作用，抗VEGF治療理論上可通過(guò)阻斷以上信號(hào)通路起到抑制EMT和PVR的發(fā)展。目前，已經(jīng)有很多的研究在動(dòng)物和臨床進(jìn)行了嘗試，也有了一些發(fā)現(xiàn)。

5.1抗VEGF治療對(duì)實(shí)驗(yàn)性PVR的作用Pennock等[29-30]在兔眼玻璃體內(nèi)注射0.1mL全氟丙烷氣體造成部分玻璃體后脫離，1wk后將成纖維細(xì)胞、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聯(lián)合注入玻璃體制備復(fù)合PVR模型。利用此模型，研究者證實(shí)了玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗和阿柏西普均能有效抑制PVR的發(fā)生，且視網(wǎng)膜的形態(tài)及功能未受影響。Daftarian等[31]在白化兔眼玻璃體內(nèi)注射0.3mL六氟化硫氣體造成玻璃體后脫離，3d后將人RPE細(xì)胞注入玻璃體制備PVR模型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CTGF在PVR早期表達(dá)水平明顯增高。玻璃體內(nèi)注射抗CTGF藥物可降低VEGF-A表達(dá)，阻斷VEGF-A的功能。單獨(dú)抗CTGF藥物及聯(lián)合抗VEGF治療可顯著抑制視網(wǎng)膜下纖維化，表現(xiàn)為增殖膜厚度、膠原纖維面積及肌成纖維細(xì)胞密度降低。而單純抗VEGF治療僅在PVR早期通過(guò)與PDGFR的相互作用降低增殖膜厚度，對(duì)膠原纖維面積及肌成纖維細(xì)胞密度無(wú)明顯影響。

5.2抗VEGF治療在臨床上對(duì)PVR的防治效果不同于動(dòng)物研究的結(jié)論，多個(gè)臨床研究顯示，與單純玻璃體腔硅油填充相比，硅油填充聯(lián)合貝伐單抗注射并不能提高PVR患者的視網(wǎng)膜復(fù)位率、改善術(shù)后視力及降低術(shù)后PVR發(fā)生率[32-33]。 Ghasemi等[32]還發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔硅油填充聯(lián)合貝伐單抗注射術(shù)后視網(wǎng)膜再脫離患者中，55.5%患者的視網(wǎng)膜可見廣泛的纖維增殖膜，提示抗VEGF治療可能加重了PVR。

5.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究差異的原因關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究結(jié)果的差異，目前認(rèn)為可歸于四個(gè)主要原因[5]：(1)PVR是一種由多種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及大量自分泌或旁分泌的細(xì)胞因子混合作用的復(fù)雜病理過(guò)程，單一藥物很難在多種致病環(huán)節(jié)中均發(fā)揮作用；(2)目前的動(dòng)物模型均不能完全準(zhǔn)確地反映臨床PVR發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程；(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為早期PVR，病理改變以RPE細(xì)胞增生為主。臨床入組為PVR C級(jí)，此時(shí)的病理改變以EMT為主，因此抗VEGF藥物作用有限；(4)臨床上抗VEGF藥物抑制VEGF生物學(xué)活性的同時(shí)，會(huì)打破VEGF和CTGF之間的平衡，造成CTGF表達(dá)水平增高，從而引發(fā)纖維化，導(dǎo)致瘢痕形成和視力喪失。

對(duì)于臨床上PVR發(fā)生發(fā)展的高危眼，如年輕患者、巨大裂孔(大于90°的視網(wǎng)膜裂孔)、多發(fā)性撕裂孔、廣泛性視網(wǎng)膜脫離、伴有脈絡(luò)膜脫離的視網(wǎng)膜脫離等，PVR早期使用抗VEGF藥物，是否可有效抑制PVR的發(fā)生，尚有待進(jìn)一步研究。

6小結(jié)及展望

手術(shù)設(shè)備和方式的創(chuàng)新顯著提高了PVR患者術(shù)后的解剖復(fù)位率，基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)加深了我們對(duì)PVR發(fā)病機(jī)制的理解。然而，由于PVR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前也遠(yuǎn)未闡明，因此其治療仍是一大難題。PVR的發(fā)生是多種細(xì)胞和多種因子聯(lián)合作用的結(jié)果，雖然新的研究證實(shí)了VEGF及EMT在PVR發(fā)生發(fā)展中起著一定作用，但有關(guān)VEGF和EMT在PVR不同階段的作用、二者的聯(lián)動(dòng)關(guān)系、抗VEGF治療對(duì)EMT的潛在影響、治療時(shí)機(jī)以及對(duì)臨床PVR的防治效果等還需進(jìn)一步研究和探索。同時(shí)，在臨床試驗(yàn)尚未明確其療效的情況下，將抗VEGF用于臨床PVR的治療需要非常謹(jǐn)慎。