安 寧，張福燕，秦 波

0引言

細胞在多次分裂增殖期間發(fā)生分子生物學或基因的改變，產(chǎn)生細胞狀態(tài)或類型的多樣性，這種多樣性被稱為細胞異質(zhì)性，普遍存在于多細胞生物個體中。傳統(tǒng)的測序方法忽視細胞異質(zhì)性，只能反映細胞群體的平均差異，而單細胞技術(shù)可揭示細胞間異質(zhì)性，在更深層次上探究生命活動的本質(zhì)和規(guī)律。2013年單細胞測序技術(shù)被Science評為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首，NatureMethods將該技術(shù)評為2013年度最重要的方法學，2015年再度登上ScienceTranslationalMedicine封面，2018年單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)被Science評為年度突破技術(shù)，2019/2020年單細胞多組學和單細胞空間轉(zhuǎn)錄組測序再次評為年度技術(shù)，成為最值得期待的生物技術(shù)之一。scRNA-seq在單細胞水平對轉(zhuǎn)錄組進行擴增與測序，直接比較來自不同生物條件的細胞轉(zhuǎn)錄組信息，對細胞分群、發(fā)現(xiàn)新的細胞類型、識別疾病進展中起重要作用的罕見細胞、理解細胞異質(zhì)性、生物多樣性等具有重要意義。目前scRNA-seq已被應用于眼科領(lǐng)域，其在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜生理學、視網(wǎng)膜疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)中的研究日新月異，為探究ARMD病因，發(fā)展規(guī)律和靶向治療提供新的視角。

1 scRNA-seq技術(shù)簡介

scRNA-seq是在單細胞水平對轉(zhuǎn)錄組進行測序的一項新技術(shù)，其技術(shù)路線包括單細胞捕獲、mRNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA擴增、測序文庫構(gòu)建、高通量測序和數(shù)據(jù)分析[1]。目前提取單細胞的方法有：熒光激活細胞分選、激光捕獲顯微切割、手動細胞分選、微流體和微孔等[2]。一個單細胞中的總RNA量大約只有10pg，而其中的mRNA含量只有0.2pg，為獲得足夠的轉(zhuǎn)錄信息，需要進行擴增，目前常用的擴增方法包括PCR擴增法、IVT擴增法、等溫擴增法等，其中PCR擴增法中的Smart-seq(switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)/Smart-seq2具有里程碑意義[3-4]，其利用mRNA識別序列、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等方法既能將mRNA高效擴增到需要的數(shù)量級，又可盡量避免PCR偏差而得到均一覆蓋的文庫。IVT擴增如CEL-seq(cell expression by linear amplifcation and sequencing)/CEL-seq2[5]采用線性擴增的測序方法使擴增錯誤率降低。利用Phi29聚合酶進行擴增的PMA法[6]屬于等溫擴增法，但擴增隨機性大，時常會導致整個基因組不同區(qū)域的擴增倍數(shù)相差巨大。目前常用的單細胞測序平臺是基于微流控體系的10X Genomis公司的液滴法[7]及BD公司的微孔法[8]，它們把單細胞提取、附加DNA標簽、mRNA捕獲、mRNA反轉(zhuǎn)錄與擴增、cDNA建庫和高通量測序后的數(shù)據(jù)分析整合在一起，大大提升了單細胞測序通量和成本，還能得到帶有獨特分子標簽的單細胞基因序列信息。液滴法通過微流控技術(shù)將帶有barcode、UMI分子標簽、引物及酶的凝膠微珠與單細胞混合形成顆粒，做出一個基于油包水乳濁液酶反應原理的分子生物學分析系統(tǒng)。微孔法是將細胞懸液與標記磁珠加入含有約200000個孔的蜂窩板，每個孔中容納一個細胞，不僅可一次性捕獲大量細胞，還能同時實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測序。獲得的海量數(shù)據(jù)需要進一步處理分析，進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、基因組對比、數(shù)據(jù)歸一化(包括消除基因特異性偏差和調(diào)整細胞間計數(shù)分布差異等)，然后使用細胞聚類分析、主成分分析和t-分布隨機鄰域嵌入算法等進行線性與非線性降維，實現(xiàn)對高維數(shù)據(jù)的降維和可視化[9-10]，最終獲得大量單細胞基因序列信息。

2 scRNA-seq在神經(jīng)視網(wǎng)膜研究中的應用

2.1scRNA-seq在神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞類型鑒定中的應用scRNA-seq在眼科中的應用主要集中在視網(wǎng)膜細胞亞型、相關(guān)基因表達和通路的研究上。視網(wǎng)膜是高度異質(zhì)性的組織，通過形態(tài)學、生理學和分子學標準將神經(jīng)視網(wǎng)膜分為神經(jīng)節(jié)細胞、雙極細胞、無長突細胞、水平細胞、光感受器細胞5種類型，scRNA-seq還可將其再細分為100多種細胞亞型[11]。例如，Rheaume等[12]確定了40個不同的鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞簇，并在每種細胞類型中鑒定了富集的基因，且在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞亞型中確定了區(qū)分左右眼的特異性標記基因，Shekhar等[13]將鼠雙極細胞分為15個細胞簇，Macosko等[14]在小鼠視網(wǎng)膜中鑒定了21個不同的無長突細胞簇。細胞亞型的進一步細化分類，能將細胞的基因表達特征與其功能和形態(tài)學特征聯(lián)系起來。

2.2scRNA-seq在黃斑中心凹與外周神經(jīng)視網(wǎng)膜差異基因分析中的應用黃斑中心凹處的神經(jīng)元信息傳遞呈單線連接，故此區(qū)視覺非常敏銳，當黃斑區(qū)病變時，視力明顯下降，為比較黃斑中心凹與外周神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞的區(qū)別，有研究從死亡后6h內(nèi)處理的三組人類供體眼獲得中心凹和外周神經(jīng)視網(wǎng)膜樣本，得到8217個細胞，scRNA-seq發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)視網(wǎng)膜視錐細胞明顯少于中心凹，且中心凹視錐細胞富含PCP4、YBX1、PRDX1等，其分別在突觸可塑性蛋白形成、細胞增殖和應激反應中發(fā)揮作用[15-17]。此外，Banin等[18]報道了黃斑區(qū)20個高表達基因(如SLC17A6、SNCG、NEFL、NET1、STMN2、YWHAH、UCHL1、DPYSL2、APP、NDRG4、TUBA1B、MDH1、EEF2)和23個在視網(wǎng)膜周邊區(qū)域高表達的基因(如SAG、RCVRN、UNC119、GPX3、PDE6G、ROM1、ABCA4、DDC、PDE6B、GNB1、NRL)。中心凹Müller細胞也表現(xiàn)出不同于外周神經(jīng)視網(wǎng)膜的基因表達譜，中央凹Müller細胞富含F(xiàn)ABP5(參與神經(jīng)元分化和神經(jīng)元損傷的恢復[19])、HES5(與膠質(zhì)形成有關(guān))，外周Müller細胞富含轉(zhuǎn)鐵蛋白和金屬硫蛋白基因家族成員MT1G和MT3。且總體而言，Müller細胞的許多基因在不同的單細胞數(shù)據(jù)集上表現(xiàn)出一致的中心凹或外周神經(jīng)視網(wǎng)膜富集。這些研究提供了黃斑中心凹具有敏銳視覺的理論支持。

3 scRNA-seq在視網(wǎng)膜色素上皮層和脈絡(luò)膜研究中的應用

3.1scRNA-seq在視網(wǎng)膜色素上皮層和脈絡(luò)膜生理學研究中的應用視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pignebt epithelium,RPE)與脈絡(luò)膜聯(lián)系緊密，RPE-玻璃膜-脈絡(luò)膜毛細血管復合體對維持光感受器微環(huán)境有重要作用，RPE為感覺層視網(wǎng)膜的外層細胞提供營養(yǎng)，吞噬和消化光感受器細胞外節(jié)膜盤維持新陳代謝。脈絡(luò)膜是一種多樣化的結(jié)締組織，包括施萬細胞、黑素細胞、成纖維細胞和幾類常駐白細胞，scRNA-seq鑒定了兩組在轉(zhuǎn)錄上不同的施萬細胞簇[20]，它們均表達典型的施萬細胞標志物PLP1，其中簇1高表達髓鞘蛋白(MPZ)和髓鞘堿性蛋白(MBP)，簇2高表達非髓鞘施萬細胞基因SCN7A和NCAM1[21]，有髓軸突的傳導速度更快，但缺少髓鞘的軸突是受損軸突的快速反應者[22]。脈絡(luò)膜血管豐富，在解剖學上分為三層，深大口徑血管(Haller層)，中等口徑血管(Sattler層)，以及致密的淺表毛細血管網(wǎng)，此血管系統(tǒng)向外層視網(wǎng)膜供應約85%的血液。scRNA-seq檢測了上訴三層的特異表達基因，動脈表達SEMA3G、HEY1，靜脈表達DARC，脈絡(luò)膜毛細血管表達CA4、PLVAP[20]。ARMD的發(fā)病特征為光感受器細胞的進行性損傷，因此，研究RPE-玻璃膜-脈絡(luò)膜毛細血管復合體生理學為進一步理解ARMD發(fā)病機制有較大意義。

3.2scRNA-seq在黃斑區(qū)和外周視網(wǎng)膜色素上皮層或脈絡(luò)膜差異基因表達研究中的應用ARMD的解剖學異常集中在黃斑區(qū)RPE和脈絡(luò)膜，而某些遺傳性視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜色素變性病變位于外周視網(wǎng)膜，這種損傷模式被認為是由于黃斑區(qū)和外周RPE或脈絡(luò)膜之間的分子差異導致，激發(fā)了學者對這兩個區(qū)域分子差異的研究。Mullins等[23]利用RNA測序和qPCR研究發(fā)現(xiàn)黃斑和外周RPE或脈絡(luò)膜之間存在差異表達的基因，例如，BEST1在外周RPE細胞中高表達，ICAM1在黃斑區(qū)脈絡(luò)膜中高表達，此結(jié)果在scRNA-seq中得到印證。以往的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較黃斑區(qū)和外周RPE或脈絡(luò)膜基因后發(fā)現(xiàn)許多RPE特異性基因，如LRAT、RPE65，總體表現(xiàn)為在外周視網(wǎng)膜中的高度富集[24]，然而scRNA-seq中，這些RPE特異性基因在黃斑和外周的表達量非常相似。這種差異歸因于黃斑區(qū)與外周脈絡(luò)膜細胞密度的不同，脈絡(luò)膜在黃斑以下最厚，徑向變薄[25]，RPE特異性基因表達量被黃斑區(qū)中更多的脈絡(luò)膜細胞稀釋，使這類基因在外周視網(wǎng)膜表達顯得更高，scRNA-seq消除這一誤差，體現(xiàn)了其區(qū)別于傳統(tǒng)測序技術(shù)只反映細胞群平均差異的優(yōu)勢。scRNA-seq為深刻理解視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜生理學提供了巨大幫助，突出各種細胞類型之間的特征，提高對視網(wǎng)膜生理和疾病區(qū)域特異性的理解，為如何應對視網(wǎng)膜損傷提供新的方向。

4 scRNA-seq在ARMD研究中的應用

ARMD能導致患者中心視力的不可逆損傷，是嚴重的致盲性眼病，臨床上將其分為以視網(wǎng)膜玻璃膜疣為特征的干性ARMD和以新生血管生長為特征的濕性ARMD，其與炎癥反應、免疫反應、氧化應激等的相關(guān)性成為近年的研究熱點。

4.1scRNA-seq在ARMD與炎癥反應相關(guān)性研究中的應用Newman等[26]從基因組水平發(fā)現(xiàn)ARMD與炎癥反應的相關(guān)性，其與許多趨化因子的高表達有關(guān)。年齡是ARMD最重要的危險因素，Voigt等[20]通過scRNA-seq確定了嬰兒和成人脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄組的差異，嬰兒內(nèi)皮細胞富含的KLF2、NR4A1、NR2F2能下調(diào)炎性表面黏附分子的表達，成人內(nèi)皮細胞則表現(xiàn)出更多促炎基因的表達，包括黏附分子VCAM1、ICAM1、SELE、SELP以及趨化因子受體ACKR3等[27]。隨著年齡的增長，脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有誘發(fā)ARMD的可能。

4.2scRNA-seq在ARMD與免疫系統(tǒng)相關(guān)性研究中的應用Newman等[26]提出細胞介導的免疫反應是ARMD的核心特征，推斷ARMD可能是一類具有共同免疫反應過程的疾病。ARMD的蛋白質(zhì)組學研究表明，脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞高度表達HLA-A抗原、CA4和PLVAP[28]等免疫因子。肥大細胞脫顆粒[29]和巨噬細胞向脈絡(luò)膜募集增加[30]與ARMD的發(fā)病有關(guān)。補體系統(tǒng)是一個復雜的固有免疫監(jiān)視系統(tǒng)，補體基因的多態(tài)性與ARMD易感性密切相關(guān)[31]，補體因子H(complement factor H,CFH)是補體替代途徑的負調(diào)節(jié)因子，CFH可增強RPE抗氧化應激的能力，該基因的單核苷酸多態(tài)性能顯著增加ARMD的患病風險[32]。多種補體基因如補體因子B(CFB)、補體因子I(CFI)、C3、C5等的單核苷酸多態(tài)性也發(fā)現(xiàn)與ARMD的發(fā)病存在顯著相關(guān)性[33]。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)CFH主要在脈絡(luò)膜中表達[20]，表達量為：脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞(動脈>毛細血管>靜脈)>脈絡(luò)膜基質(zhì)細胞(成纖維細胞和周細胞)，且脈絡(luò)膜比視網(wǎng)膜表達更多的補體抑制劑及大量重要的補體調(diào)節(jié)因子CD46、CD55、CD59、CD93，提示ARMD的補體系統(tǒng)異常主要發(fā)生在脈絡(luò)膜[20]。補體旁路途徑的異常激活使膜攻擊復合物(membrane attack complex,MAC)在脈絡(luò)膜毛細血管上大量沉積[34]，是導致脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞死亡和功能障礙進而誘發(fā)ARMD的重要原因[35]。Mullins等[36]發(fā)現(xiàn)老年人尤其是ARMD供體眼的MAC表達量高于青年供體眼，且青年供眼脈絡(luò)膜不受MAC的影響。RGCC基因為重要的補體應答基因，MAC一旦被激活，RGCC就會增加炎癥基因的表達[37]并驅(qū)動血管功能障礙，scRNA-seq發(fā)現(xiàn)ARMD脈絡(luò)膜毛細血管中含有豐富的RGCC[20]，認為其可能作為ARMD治療的靶標基因。細胞介導的免疫反應、補體基因的異常表達、補體旁路的異常激活與ARMD的易感性密切相關(guān)，scRNA-seq加強了對ARMD發(fā)病機制與免疫反應相關(guān)性的深入理解，對靶向免疫治療ARMD有重要意義。

4.3scRNA-seq在ARMD與氧化應激反應相關(guān)性研究中的應用氧化應激是ARMD的發(fā)病機制之一，視網(wǎng)膜內(nèi)的鐵代謝失調(diào)被認為是導致自由基產(chǎn)生進而誘發(fā)氧化應激的原因，轉(zhuǎn)鐵蛋白在ARMD患者中的表達增加[38]，缺乏視網(wǎng)膜鐵結(jié)合蛋白的小鼠會出現(xiàn)RPE和脈絡(luò)膜損傷[39]。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)[20]與外周視網(wǎng)膜相比，中心凹轉(zhuǎn)鐵蛋白表達量少，提示中心凹轉(zhuǎn)鐵蛋白的相對缺乏可能會增加該區(qū)域內(nèi)氧化損傷的易感性。人類和靈長類動物中心凹含有大量的葉黃素類胡蘿卜素，它能保護視網(wǎng)膜免受氧化損傷，scRNA-seq中[20]，類胡蘿卜素裂解酶BCO2在外周視錐感光細胞中富集，而在中心凹較少[15]，提示類胡蘿卜素在中心凹積累的機制。因此，使用抗氧化應激類藥物可能對ARMD的治療有效。

4.4scRNA-seq在濕性ARMD基因表達研究中的應用濕性ARMD又稱滲出性或新生血管性ARMD，較干性ARMD少見，但能迅速導致視力下降、視物變形或中心暗點?；趕cRNA-seq對濕性ARMD的研究中，脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞富集基因Egr1[20]能在細胞應激反應中迅速激活，被視為內(nèi)皮細胞損傷反應的關(guān)鍵介質(zhì)，且能上調(diào)與血管功能有關(guān)基因如PDGF、FGF、TGFB、TNFA、ICAM1等的表達。ATF3基因在濕性ARMD供體的脈絡(luò)膜毛細血管中富集，并能被包括DNA損傷和氧化應激的多種細胞應激源激活。Menon等[40]從6個ARMD人類供體眼黃斑部和外周視網(wǎng)膜中獲得約23339個細胞，發(fā)現(xiàn)TIMP3、VEGFA、COL4A3基因在ARMD患者的視網(wǎng)膜中高表達，TIMP3和VEGFA被證實與新生血管有關(guān)[41]。Rohlenova等[42]誘導小鼠產(chǎn)生脈絡(luò)膜新生血管，進行了一項針對小鼠脈絡(luò)膜新生血管內(nèi)皮細胞基因表達變化的scRNA-seq研究，發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出與糖酵解、ATP合成和膜運輸有關(guān)的幾個代謝基因的異常表達，說明此狀態(tài)下的內(nèi)皮細胞代謝需求極高。來自這個小鼠脈絡(luò)膜新生血管細胞模型中的15個最豐富的基因，其中有11個在人類濕性ARMD供體中表現(xiàn)出一定程度的富集。基于scRNA-seq發(fā)現(xiàn)與濕性ARMD相關(guān)基因的表達，為臨床針對靶基因治療濕性ARMD提供理論依據(jù)。

5新興單細胞測序技術(shù)的不斷探索

雖然scRNA-seq已成為剖析細胞異質(zhì)性的重要工具，但細胞異質(zhì)性體現(xiàn)在基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、空間，甚至時間等多個維度上，scRNA-seq僅局限于一維層面的測序是不完整的，因此，許多新興的單細胞測序技術(shù)應運而生?？臻g轉(zhuǎn)錄組學從一個完整的組織樣本中獲取全部的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，能夠定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的表達情況[43]。目前的scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學只提供了基因表達的靜態(tài)信息，這違背了RNA動力學和轉(zhuǎn)錄活動的隨機性，基于時間序列的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析可以揭示細胞生物信息的時間動態(tài)[44]。單細胞的異質(zhì)性本質(zhì)上是由基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀基因組共同定義的，單細胞多組學能對同一細胞同時整合多種組學數(shù)據(jù)，更完善了細胞的遺傳信息[45]。然而，這些技術(shù)在眼科領(lǐng)域中的應用仍相對局限單薄，隨著研究者持續(xù)不斷的探索，相信單細胞測序技術(shù)多元化、多維化、多方面的研究在不久后將惠及眼科研究領(lǐng)域。

6總結(jié)與展望

scRNA-seq從單細胞水平分析細胞異質(zhì)性，是鑒別細胞與細胞間轉(zhuǎn)錄組差異的新興技術(shù)。本文總結(jié)了scRNA-seq在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜發(fā)育及ARMD研究中的應用，展示細胞發(fā)揮生理學作用與其所表達基因的相互關(guān)系，加深了對視網(wǎng)膜細胞生物學和疾病病理生理學的理解。scRNA-seq將轉(zhuǎn)錄信息與ARMD發(fā)病機制相結(jié)合，為深入理解ARMD發(fā)病機制及靶向診治方案提供了全新的思路。隨著scRNA-seq測序成本的不斷降低，學者實現(xiàn)更多方面的生物學和技術(shù)重復，從而提高了不同生物學條件下檢測的多樣性和一致性，大量的研究將促進新一代視網(wǎng)膜疾病診治的發(fā)展。但scRNA-seq局限于對細胞異質(zhì)性一維層面的理解仍存在較大缺陷，空間轉(zhuǎn)錄組學、時間分辨測序、多組學以多維、豐富的研究賦予細胞異質(zhì)性更完整多態(tài)的理解，隨著眾多突破性技術(shù)的出現(xiàn)，單細胞測序在眼科領(lǐng)域中的應用將會朝著更多元化的方向發(fā)展。