胡 晗,王曉琴,聶 浩
糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是一種進行性無癥狀的糖尿病微血管并發(fā)癥,可引發(fā)不可逆的視網(wǎng)膜損傷[1]。DR發(fā)生的基礎是長期高糖環(huán)境、持續(xù)的氧化應激或炎癥刺激,進而引起內(nèi)皮細胞損傷,導致局部缺氧,繼而誘發(fā)新生血管生成[2]。視網(wǎng)膜新生血管可引起玻璃體出血和牽引性視網(wǎng)膜脫離,導致視力下降,故DR是導致成年人失明的主要原因[3]。盡管嚴格控制血糖、高血壓和高脂血癥仍是DR初始治療的主要策略,但與DR相關的癥狀僅在病變處于晚期狀態(tài)時才會出現(xiàn),因此限制了許多患者治療的有效性[4]。氧化應激是DR病變的一個關鍵因素,既可導致高血糖引起的代謝異常,也可由高血糖引起的代謝異常引起[5]。因此,通過抑制氧化應激和保護內(nèi)皮細胞對于防治DR具有重要意義。
黃芪性味甘溫,主歸脾肺二經(jīng),具有補中益氣、健脾益肺、托毒生肌之功效。現(xiàn)代藥理研究表明,黃芪具有多種功效,包括免疫調(diào)節(jié)[6]、降血糖和改善胰島素敏感性[7]、抗炎作用[8]、抗氧化作用[9]、抗病毒作用[10]、抗腫瘤作用[11]、保護心血管功能[12]等。先前已有研究表明黃芪及其活性成分可通過抗氧化應激對糖尿病腎病等疾病有明顯改善作用[13],而氧化應激在DR的發(fā)病機制中起著重要作用。它通過調(diào)控細胞凋亡和神經(jīng)變性導致線粒體功能障礙、炎癥和細胞死亡,從而導致血管、神經(jīng)和視網(wǎng)膜組織損傷[14]。因此,抑制氧化應激和新生血管形成對于防治DR具有重要意義。但黃芪是否能在DR的病理生理過程中抑制缺氧誘導的氧化應激尚不清楚。故本實驗采用CoCl2誘導的ARPE-19細胞缺氧損傷模型,從抗氧化角度研究黃芪含藥血清對視網(wǎng)膜色素上皮細胞的保護作用,進一步探討其防治DR的作用機制。
1.1材料雄性SD大鼠(SPF級)20只,體質(zhì)量250±20g,購于三峽大學實驗動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2017-0012,該動物實驗經(jīng)過長江大學動物倫理委員會(中國荊州)批準。人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。黃芪(貨號200601)購于湖北省荊州市中醫(yī)院;CoCl2·6H2O(貨號20200407)購于上海沃凱生物公司;CCK-8檢測試劑盒(貨號BS350B)購于蘭杰柯科技有限公司;還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒(貨號:BC1175)、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(貨號BC0025)購于北京索萊寶公司;Human HIF-1α ELISA Kit(貨號PH368)、Human VEGF ELISA Kit(貨號PV963)、VEGF anti-body(貨號AF0312)購于北京碧云天生物公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit(貨號3733)、TB Green?Premix Ex TaqTMI Kit(貨號RR820A)購于日本TaKaRa公司;HIF-1α Rabbit mAb(貨號36169S)、脯氨酸羥化酶-2(PHD-2)Rabbit mAb(貨號4835S)購買于Cell Signaling Technology生物公司。
1.2方法
1.2.1含藥血清獲取及CoCl2溶液制備大鼠黃芪的給藥劑量為10mL/kg連續(xù)灌胃7d,于末次給藥1h后,用戊巴比妥腹腔注射麻醉后采用腹主動脈收集血液,待血液凝固后,4℃、3600r/min離心15min,分離血清。然后經(jīng)56℃水浴30min滅活,再通過0.22μm微孔濾膜過濾除菌,存放在-20℃冰箱中備用。稱取0.2379g CoCl2·6H2O溶于1L的DMEM培養(yǎng)基中,充分混勻,再通過0.22μm微孔濾膜過濾除菌,即為200μmol/L的CoCl2溶液,4℃避光保存。
1.2.2缺氧模型的建立ARPE-19細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(含雙抗)培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞制備細胞懸液,以5×103/孔接種于96孔板,待細胞貼壁后,每孔分別加入終濃度為含0、100、200、400、800、1600μmol/L CoCl2的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。CCK-8法檢測細胞增殖活性,篩選最佳造模濃度(200μmol/L)。
1.2.3實驗分組細胞以5×103/孔接種于96孔板,待細胞貼壁后,實驗分為正常組(細胞正常培養(yǎng),不加任何處理)、缺氧模型組(200μmol/L CoCl2)、空白血清組(200μmol/L CoCl2+空白血清)、低劑量含藥血清組(200μmol/L CoCl2+10%含藥血清)、高劑量含藥血清組(200μmol/L CoCl2+20%含藥血清)。細胞培養(yǎng)24h后,一部分細胞用于CCK-8法檢測細胞活力;其余細胞收集上清培養(yǎng)液檢測GSH活性、MDA含量、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的水平,收集底部細胞用于Western blot、實時熒光定量PCR(qPCR)檢測。
1.2.4CCK-8檢測細胞活性取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的ARPE-19細胞制備成5×103/mL細胞懸液,接種于96孔板中(每孔100μL),待細胞貼壁后按照實驗需要給予含不同濃度藥物的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,再每孔加入10μL CCK-8溶液,細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后,用酶標儀測定450nm處的OD值。
1.2.5氧化應激指標的檢測GSH和MDA的含量使用商業(yè)檢測試劑盒測量,所有步驟均按照說明書操作,通過酶標儀設定特定波長(GSH檢測波長:412nm;MDA檢測波長:532nm),檢測各個孔的OD值,計算結果。
1.2.6ELISA檢測細胞培養(yǎng)基中VEGF和HIF-1α的含量按ELISA試劑盒說明書操作,測量細胞上清培養(yǎng)液中VEGF、HIF-1α水平,酶標儀設定波長為450nm,檢測各孔的OD值,以建立標準曲線得到濃度與OD值之間的換算公式,以此計算結果。
1.2.7qPCR檢測VEGF和HIF-1α及PHD-2的mRNA水平使用TRIzol法進行總RNA的提取,然后使用PrimeScript RT試劑盒按說明書操作將RNA逆轉錄成cDNA。qPCR使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒按說明書進行操作。采用2-ΔΔCt方法測量靶基因對 GAPDH 的相對表達。引物序列見表1。
表1 引物序列
1.2.8WesternBlot法檢測VEGF和HIF-1α及PHD-2的表達情況首先用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解細胞提取總蛋白,使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度,在100℃水浴鍋中變性10min;然后等量的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉至PVDF膜上,接著在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h后,在4℃下與相應的一抗孵育過夜,用TBST緩沖液洗滌10min×3次;再加入對應二抗室溫孵育1h后,將PVDF膜放入壓片盒中,用ECL顯色液顯色,壓片曝光,定影洗片,掃描結果;最終使用Image J軟件進行定量分析。
2.1建立缺氧細胞模型的最佳CoCl2濃度結果CCK-8結果顯示,不同濃度(0、100、200、400、800、1600μmol/L)CoCl2處理ARPE-19細胞24h后,細胞增殖活性對應的OD值分別為1.31±0.07、1.63±0.05、1.81±0.05、0.92±0.08、0.34±0.01、0.16±0.02,差異有統(tǒng)計學意義(F=98.51,P<0.001)。與正常組相比,細胞活性呈現(xiàn)先增長后抑制情況,當CoCl2濃度為200μmol/L時,細胞活性最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);隨著CoCl2濃度增加(400、800和1600μmol/L),其對應的OD值隨之下降,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。故本實驗選擇200μmol/L的CoCl2濃度作為ARPE-19細胞缺氧模型的最佳濃度。
圖1 不同濃度CoCl2對ARPE-19細胞增殖活性的影響(n=6) aP<0.05 vs 正常組。
2.2黃芪含藥血清可抑制缺氧誘導的ARPE-19細胞增殖通過CCK-8檢測黃芪含藥血清對缺氧誘導的ARPE-19細胞增殖能力的影響,結果顯示正常組、缺氧模型組、空白血清組、低劑量含藥血清組、高劑量含藥血清組對應的OD值分別為0.65±0.05、1.21±0.09、1.23±0.05、0.96±0.09、0.82±0.04,差異有統(tǒng)計學意義(F=75.51,P<0.001)。如圖2A所示,與正常組相比,缺氧模型組中細胞增殖明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而與缺氧模型組相比低劑量、高劑量含藥血清組均可明顯降低缺氧誘導的ARPE-19細胞增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中高劑量含藥血清組細胞增殖明顯低于低劑量含藥血清組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而空白血清組細胞增殖與缺氧模型組,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外,通過倒置顯微鏡對各個組的細胞增殖情況進行拍照,缺氧模型組和空白血清組細胞數(shù)相對于正常組明顯增加,而低劑量、高劑量含藥血清組細胞數(shù)相對于缺氧模型組明顯減少(圖2B)。因此,低劑量和高劑量黃芪含藥血清處理均會抑制缺氧誘導的ARPE-19細胞增殖。
圖2 黃芪含藥血清對ARPE-19細胞增殖活性的影響(n=6) A:CCK-8檢測細胞活性;B:細胞增殖情況;aP<0.05 vs 正常組;cP<0.05 vs 缺氧模型組。
2.3黃芪含藥血清對缺氧誘導損傷細胞上清液中的GSH和MDA含量的影響各組細胞上清液中的GSH和MDA的含量比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與正常組相比,缺氧模型組細胞上清液中GSH含量顯著下降,而MDA含量升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與缺氧模型組比較,低劑量、高劑量含藥血清組GSH水平升高,MDA含量降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。以上結果表明,低劑量和高劑量黃芪含藥血清可改善ARPE-19細胞缺氧損傷的氧化應激。
表2 各組細胞上清液中GSH和MDA含量比較
2.4黃芪含藥血清對缺氧誘導損傷細胞上清液中HIF-1α和VEGF表達的影響各組細胞上清液中HIF-1α和VEGF蛋白濃度比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與正常組相比,缺氧模型組中ARPE-19細胞分泌HIF-1α和VEGF增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而與缺氧模型組相比,低劑量、高劑量含藥血清組均可明顯降低HIF-1α和VEGF的分泌,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。表明低劑量和高劑量黃芪含藥血清可抑制ARPE-19細胞缺氧損傷中HIF-1α和VEGF的表達。
表3 各組細胞上清液中HIF-1α和VEGF蛋白濃度比較
2.5黃芪含藥血清對缺氧誘導損傷細胞的VEGF和HIF-1α及PHD-2mRNA表達的影響各組細胞的VEGF和HIF-1α及PHD-2 mRNA表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。缺氧模型組中VEGF、HIF-1α和PHD-2 mRNA的表達較正常組顯著增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與缺氧模型組相比,黃芪含藥血清組以劑量依賴性方式顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4。結果表明低劑量和高劑量黃芪含藥血清可以抑制缺氧誘導的VEGF、HIF-1α和PHD-2 mRNA的高表達。
表4 各組間VEGF和HIF-1α及PHD-2 mRNA相對表達量
2.6黃芪含藥血清對缺氧誘導的ARPE-19細胞相關蛋白表達的影響各組間VEGF和HIF-1α及PHD-2蛋白相對表達量比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。缺氧模型組中VEGF、HIF-1α和PHD-2蛋白水平均明顯高于正常組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與缺氧模型組相比,低劑量、高劑量含藥血清組VEGF、HIF-1α和PHD-2蛋白水平明顯下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表5,圖3。低劑量和高劑量黃芪含藥血清處理可抑制缺氧誘導的ARPE-19細胞中VEGF、HIF-1α和PHD-2蛋白表達水平。
表5 各組間VEGF和HIF-1α及PHD-2蛋白相對表達量
圖3 Western blot檢測缺氧誘導損傷細胞中相關蛋白表達情況。
作為糖尿病的嚴重并發(fā)癥,DR是導致視力障礙的最常見原因之一,其患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[15]。目前基于抗氧化、抗炎和抗血管生成藥物和激光光凝的DR治療方法是有效的,但也會對視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生不良反應。因此,需要一種安全有效的治療方式來控制或延遲DR的發(fā)生。黃芪具有多種藥理特性,如清除機體氧自由基代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)免疫、降低血糖和保護大腦的作用[7]。然而黃芪在DR的作用機制尚未清楚。故本研究采用200μmol/L的CoCl2來誘導ARPE-19細胞缺氧模型,旨在探討黃芪對缺氧誘導DR的保護作用及其可能機制。
VEGF是一種關鍵的血管生成因子,參與多種生物過程,包括胚胎發(fā)育和腫瘤進展[16]。此外,VEGF是眼內(nèi)新生血管形成的主要介質(zhì),在糖尿病視網(wǎng)膜病變的病因學中起關鍵作用[17]。HIF-1α是VEGF的主要上游調(diào)節(jié)劑[18]。在缺氧條件下,脯氨酰羥化酶失活,HIF-1α降解受到抑制,導致其積累,并與HIF-1β結合產(chǎn)生功能性異二聚體轉錄因子[19]。然而,HIF-1α可以在正常條件下可被PHD-2羥基化;羥基化的HIF-1α在蛋白酶體中被泛素化和降解;相反,PHD-2的mRNA表達通過HIF-1α依賴性信號通路被缺氧上調(diào)[20]。因此,HIF-1α增加誘導了缺氧條件下VEGF的表達,導致血管通透性和視網(wǎng)膜新生血管增加。另一方面,抑制HIF-1α可以防止缺氧條件下的視網(wǎng)膜新生血管形成[21]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了VEGF、HIF-1α和PHD-2的mRNA及蛋白可在缺氧條件下表達顯著增加;而黃芪則以劑量依賴的方式抑制其表達。因此,黃芪通過HIF-1α/VEGF信號通路抑制VEGF的分泌。
氧化應激已被證實是DR發(fā)病機制的一個重要因素[5]。HIF-1α的穩(wěn)定會促進活性氧(reactive oxygen species, ROS)的合成,而ROS的過度產(chǎn)生有助于DR病變的許多跡象的發(fā)展,從血管滲漏和血管功能障礙到病理性血管生成[22]。在一些情況下,ROS的這些不同作用是通過它們的脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物而發(fā)揮作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,可作為氧化應激和組織損傷的良好標志物[23]。在缺氧條件下,GSH等抗氧化酶大量消耗,使得視網(wǎng)膜色素上皮細胞處于氧化應激狀態(tài),誘導細胞凋亡和新血管生成,導致早期DR血流動力學改變和微血管病變[24]。此外,有研究表明,由CoCl2引起的細胞缺氧和隨后積累的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物誘導的氧化應激促進了VEGF基因的表達[25]。而VEGF表達增加可能取決于ROS激活轉錄因子HIF-1α以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平的增加,這可能是視網(wǎng)膜病變中新血管生成的可能機制之一[26]。本研究發(fā)現(xiàn),在缺氧條件下,細胞上清液中GSH水平顯著下降,而黃芪則是以劑量依賴的方式提高細胞上清液中GSH水平;同時,缺氧條件下細胞上清液中MDA水平顯著升高,而黃芪則是以劑量依賴的方式降低細胞的MDA水平。提示黃芪可能通過增強細胞的抗氧化能力,從而對抗缺氧損傷。
在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量黃芪含藥血清確實可以抑制缺氧條件下ARPE-19細胞的VEGF分泌,下調(diào)VEGF、HIF-1α和PHD-2的mRNA及蛋白表達。此外,結果還表明黃芪則是以劑量依賴的方式抑制缺氧誘導的氧化應激的發(fā)生。因此,我們的研究結果表明黃芪對缺氧誘導的ARPE-19細胞損傷具有一定的保護作用,其可能機制是通過抑制氧化應激來改善DR病變發(fā)生。這一研究發(fā)現(xiàn)可為臨床上黃芪治療DR提供新的見解。