曾輝苑，劉國棟，林 麗，劉愛勝，梁秀文

妊娠相關(guān)血漿蛋白A（pregnancy-associated plasma protein-A，PAPP-A）是一種與胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）相關(guān)的金屬螯合蛋白酶。其水平與多種慢性炎癥性疾病有關(guān)，多用于冠心病和高血壓的診療[1~3]。最近研究發(fā)現(xiàn)PAPP-A又是一種與妊娠相關(guān)的糖蛋白，與多種婦產(chǎn)科疾病有關(guān)，其中妊娠期高血壓（gestational hypertension，GH）與PAPP-A水平之間的相關(guān)性中國內(nèi)地已見少數(shù)報(bào)道，但其基因（PAPP-A）多態(tài)性與GH發(fā)病的易感性未見報(bào)道，且其基因多個(gè)位點(diǎn)呈多態(tài)性，并具有地域性差異[4，5]。筆者針對深圳龍華區(qū)GH孕婦和健康非GH孕婦PAPP-A水平及其基因rs7020782 A/C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）進(jìn)行了分析，探討其在GH發(fā)病中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 臨床材料

選擇2019年3月至2021年2月在深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院確診的GH孕婦279例（GH組），年齡24～43歲，平均年齡30.85歲（標(biāo)準(zhǔn)差6.92歲）；孕周21～35周，平均孕周28.06周（標(biāo)準(zhǔn)差7.52周）。同時(shí)選擇健康非GH孕婦108例為對照組，年齡23～45歲，平均年齡31.07歲（標(biāo)準(zhǔn)差7.38歲）；孕周20～34周，平均孕周27.54周（標(biāo)準(zhǔn)差7.01周）。所有患者及家屬知情并簽署知情同意書，且已經(jīng)筆者所在醫(yī)院倫理委員會同意批準(zhǔn)。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：①GH診斷參照《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》中GH診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并根據(jù)血壓（blood pressure，BP）高低將GH孕婦分為輕度組[140/90 mmHg≤BP<150/100 mmHg，蛋白尿（±）]125例、中度組[150/100 mmHg≤BP<160/110 mmHg，蛋白尿（+）]93例及重度組[BP>160/110 mmHg，蛋白尿（++以上）]61例；②單胎妊娠者；③初診者；④妊娠期未服過特殊藥物者；⑤孕周>20周者；⑥自愿并積極配合者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠前患慢性高血壓者；②多胎妊娠者；③復(fù)診者；④使用過抗血壓藥物者；⑤伴有嚴(yán)重的心腦血管疾病及肝腎功能損害者；⑥不自愿配合者。

兩組年齡、孕周等臨床材料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.1.2 主要試劑與儀器

PAPP-A酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技，中國）；DNA提取試劑盒（深圳亞能，中國）；乙二胺四乙酸二鉀 （ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium salt，EDTA-K2）抗凝管（山東奧賽特醫(yī)療器械公司，中國）；PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP分析試劑（華大基因，中國）。

1.2 方法

1.2.1 血液樣品采集方法

所有患者均于就診的第二天清晨采用一次性真空采血管抽取空腹靜脈血2份，其中1份2.0～3.0 mL置于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，充分混勻，用于DNA提?。涣?份3.0～4.0 mL置于無抗凝劑的干燥管內(nèi)，用于PAPP-A水平測定。

1.2.2 妊娠相關(guān)血漿蛋白A水平測定

抽取3.0～4.0 mL靜脈血置于無抗凝劑的干燥管內(nèi)，30 min后分離血清，及時(shí)檢測，否則于-20℃條件下保存；采用ELISA法進(jìn)行PAPP-A水平檢測，具體操作按照試劑盒及儀器操作說明書進(jìn)行。

1.2.3 DNA提取

抽取2.0～3.0 mL靜脈血置于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，充分混勻，用DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，將提供的DNA樣品于-70℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP分析

1.2.4.1 引物設(shè)計(jì) 上游引物：5′-CCCTCGTTTCTTTCCTCC-3′；下游引物：5′-ACCCAGTAAGCCTTCCCT-3′。由華大基因公司合成。

1.2.4.2 反應(yīng)體系 取10×緩沖溶液5.0μL、10 mmol/L dNTPs4.0μL、25 mmol/L MgCl23.0μL、20μmol/L上下游引物各1.0μL、0.1μg/μL DNA模板1.0μL、1 U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，然后加雙蒸水至50.0μL。

1.2.4.3 擴(kuò)增 94℃預(yù)變性5 min，然后以94℃變性60 s→62℃退火48 s→72℃延伸48 s，循環(huán)36次，最后以72℃延伸5 min。

1.2.4.4 酶切 取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物10.0μL、2.5 U限制性內(nèi)切酶MOWⅠ（restriction endonuclease MOWⅠ）0.5μL、緩沖溶液2.0μL及去離子水7.5μL，60℃酶切1 h。

1.2.4.5 電泳 于30 g/L瓊脂糖凝膠上加入PCR擴(kuò)增酶切產(chǎn)物，電泳40 min，分析其基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較運(yùn)用t/F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)；遺傳平衡運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組妊娠相關(guān)血漿蛋白A水平比較

GH組PAPP-A水平為（8.92±3.15）mIU/L，明顯高于對照組[（5.41±1.73）mIU/L]；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.054 8，P<0.05）。

2.2 不同組GH孕婦妊娠相關(guān)血漿蛋白A水平比較

重度組PAPP-A水平為（13.23±4.15）mIU/L，明顯高于中度組[（9.24±2.51）mIU/L]，而中度組明顯高于輕度組[（6.58±2.07）mIU/L]；不同組別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.514 3，P<0.05）。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

GH組和對照組PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP均檢出AA、AC和CC 3種基因型，經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，兩組PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.320 7，P>0.05）。說明抽樣具有樣本代表性。

2.4 兩組PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP比較

GH組PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)CC基因型和C等位基因頻率分別為30.47%和48.75%，高于對照組（9.26%和28.24%）；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且CC基因型和C等位基因患GH的相對風(fēng)險(xiǎn)增加[比值比（odds ratio，OR）=2.836，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）1.725～4.713和OR=2.016，95%CI 1.632～3.548]。見表1。

表1 GH組與對照組PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP比較Tab.1 Comparison of SNPat rs7020782 A/Clocus of PAPP-A between GH group and control group

2.5 兩組電泳結(jié)果

于30 g/L的瓊脂糖凝膠上加入PCR擴(kuò)增酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，兩組標(biāo)本的PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP均可見AA、AC及CC 3條電泳帶（圖1）。

圖1 PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP電泳圖Fig.1 SNPelectrophoresisof PAPP-A rs7020782 A/Clocus

2.6 測序結(jié)果

抽取部分PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)SNP PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣本進(jìn)行基因直接測序，符合PAPP-A基因序列（圖2）。

圖2 PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因測序圖Fig.2 Sequencing map of PCR product at rs7020782 A/Clocus of PAPP-A

2.7 不同基因型GH孕婦妊娠相關(guān)血漿蛋白A水平比較

PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)CC基因型GH孕婦PAPP-A水平為（11.98±3.76）mIU/L，明顯高于AA和AC基因型[（7.31±2.30）mIU/L和（7.80±2.54）mIU/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.705 2～7.164 0，P<0.05）；而AA和AC基因型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.105 3，P>0.05）。

3 討論

GH是婦女妊娠期特有的一種常見疾病，可導(dǎo)致多臟器功能損害，嚴(yán)重者可引起抽搐、昏迷及腦血管出血，甚至可引起彌散性血管內(nèi)凝血，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦、圍產(chǎn)兒患病及死亡的主要原因之一[7]。GH發(fā)病率全球約為7%~12%；中國內(nèi)地約為9.4%，且隨人們生活水平不斷提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變及環(huán)境不斷惡化，其發(fā)病率逐年上升，且癥狀常于妊娠20周后才出現(xiàn)，此時(shí)孕婦和胎兒已受到不同程度損傷[8，9]。GH的病因和發(fā)病機(jī)制仍不明，給臨床診斷、治療帶來很大困難。因此，尋找新的診斷標(biāo)記物，并探討其作用機(jī)制，對GH早期診斷、治療及預(yù)防具有重要的意義。

PAPP-A是由胎盤蛻膜細(xì)胞和/或合體滋養(yǎng)細(xì)胞生成的一種分泌金屬蛋白酶，其主要通過切割I(lǐng)GF結(jié)合蛋白，對代謝及免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[10~12]。GH由于全身微小動(dòng)脈痙攣，引起組織灌注不足、細(xì)胞缺血及缺氧，導(dǎo)致胎盤局部發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、自由基大量釋放及脂質(zhì)過度氧化，同時(shí)促使炎性因子大量釋放，進(jìn)而引發(fā)血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致PAPP-A分泌增加[13，14]。筆者研究結(jié)果顯示，GH孕婦血清中PAPP-A水平明顯升高，且隨GH病情加重而升高（P<0.05），與中國國內(nèi)有關(guān)研究結(jié)果基本一致[10，13，14]。這說明在排除其他可引起PAPP-A水平升高疾病外，PAPP-A水平監(jiān)測對GH早期診斷及病情判斷具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

有研究表明，GH是一種多遺傳性疾病，其發(fā)病與多種基因位點(diǎn)突變有關(guān)[15~17]。PAPP-A位于人類第9號常染色體上，其基因rs7020782 A/C位點(diǎn)易發(fā)生多態(tài)性突變，可能影響其水平表達(dá)和/或?qū)е缕浣Y(jié)構(gòu)和功能的異常，而與多種疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[4，5]。筆者研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)GH孕婦PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)CC基因型及C等位基因頻率比對照組明顯升高，且攜帶CC基因型孕婦患GH的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。這表明PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)多態(tài)性可能與GH發(fā)生有密切關(guān)系，其中CC基因型可能是該地區(qū)GH發(fā)病的遺傳危險(xiǎn)易感基因。此外，PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)不同基因型GH孕婦血清中PAPP-A水平存在很大差異，其中CC基因型孕婦最高。這表明PAPP-A水平與其基因位點(diǎn)多態(tài)性突變有密切關(guān)系，同時(shí)也說明PAPP-A在GH發(fā)病中的作用機(jī)制可能是通過其基因位點(diǎn)突變影響其水平表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，GH孕婦PAPP-A水平明顯升高，且隨病情加重而升高，在排除其他可引起其水平升高疾病外，PAPP-A水平監(jiān)測對GH早期診斷及病情判斷具有一定的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)PAPP-A rs7020782 A/C位點(diǎn)呈多態(tài)性，且與PAPP-A水平有關(guān)，有利于GH發(fā)病機(jī)制的研究。