趙淑穎，郭廣玲，董斯睿，張 超，龔琴琴，劉晨晨，計(jì)璐偉

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40歲前由于卵巢內(nèi)卵泡耗竭或被破壞，或因手術(shù)切除卵巢而發(fā)生的卵巢功能衰竭，且以低雌激素及高促性腺激素為特征，并會(huì)造成停經(jīng)、雌孕激素缺乏、骨質(zhì)疏松、膽固醇增高和皮膚缺乏彈性、乳腺萎縮、抑郁等癥狀[1]。POF在40歲以上女性發(fā)病率為1%~2%，且近年來(lái)呈上升和年輕化趨勢(shì)[2]。POF病因復(fù)雜，主要由于遺傳因素、自身免疫性疾病、環(huán)境因素、醫(yī)源性損傷（放射治療、化學(xué)治療、手術(shù)）或特發(fā)性原因引起[3]。目前對(duì)于POF的治療措施主要包括雌孕激素替代療法、基因療法、促排卵治療、免疫治療及卵巢移植等，中醫(yī)治療方法有辨證論治和針灸治療等。這些治療方法雖然對(duì)POF的臨床癥狀具有一定的緩解作用，但尚無(wú)法從根本上修復(fù)受損的卵巢功能；此外許多治療方法有較多的不良反應(yīng)，因此現(xiàn)階段針對(duì)POF無(wú)完全有效的治療方法[4]。因此亟需尋求一種新的治療方案。而干細(xì)胞的出現(xiàn)給研究學(xué)者帶來(lái)很大希望。人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）對(duì)人體組織和器官有修復(fù)再生的能力，且沒(méi)有醫(yī)學(xué)倫理的困擾[5]。有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可在卵巢中定向遷移到受損的部位，在小鼠模型中被證明可以恢復(fù)卵巢功能并改善生育能力[6]。hUCMSCs還具有強(qiáng)增殖分化能力、低免疫原性、易于分離擴(kuò)增、病毒和微生物的感染概率低、采集方便等優(yōu)勢(shì)，因其顯著優(yōu)點(diǎn)而成為理想的干細(xì)胞來(lái)源。筆者應(yīng)用hUCMSCs移植治療由環(huán)磷酰胺（cyclophosphamidec，CTX）導(dǎo)致的小鼠POF。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

選擇SPF（specific pathogen free）級(jí)ICR（Institute of Cancer Research）雌性小鼠40只，鼠齡8周，體質(zhì)量25～30 g。均由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（鄂）2019-0031。給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料，保持室溫為21℃～25℃、相對(duì)濕度50%～70%的條件下，每天光照12 h，自由飲食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周；實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，將動(dòng)情周期正常38只小鼠納入實(shí)驗(yàn)，排除2只無(wú)正常動(dòng)情周期小鼠。

hUCMSCs原代細(xì)胞由武漢中源協(xié)和有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀備

CTX（粉劑，每支200 mg）（蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó)）；蘇木精染液、伊紅染液及4%多聚甲醛溶液（福州飛凈生物科技有限公司，中國(guó)）。酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司，中國(guó)）。

光學(xué)顯微鏡（BX53+DP74。奧林巴斯，日本）；全自動(dòng)染色機(jī)（達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)）、切片機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司，中國(guó)]；InfintiteF50酶標(biāo)儀（奧地利）；離心機(jī)（飛鴿，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取原代hUCMSCs，吸棄多余的培養(yǎng)液，繼而放于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2中繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞貼壁到達(dá)90%以上。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行沖洗、胰蛋白酶消化，血清進(jìn)行消化終止。離心、去除上清液后，將細(xì)胞配成2×106/mL單細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 動(dòng)物分組、建模

將SPF級(jí)ICR小鼠采用SPSS生成隨機(jī)數(shù)字的方法分成3組，空白對(duì)照組（正常小鼠）10只，POF模型組（POF組）與hUCMSCs實(shí)驗(yàn)組（hUCMSCs組）各14只?？瞻讓?duì)照組不做任何處理；POF組與hUCMSCs組小鼠每天均腹腔注射CTX 70 mg/kg[7]，連續(xù)給藥15 d。以動(dòng)情周期紊亂和動(dòng)情間期延長(zhǎng)為判斷建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 給藥方案與檢測(cè)

建模成功后第1天，hUCMSCs組經(jīng)尾靜脈注射hUCMSCs進(jìn)行治療，POF組注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。3組在hUCMSCs移植后的7 d、14 d分別進(jìn)行小鼠眼眶采集靜脈血并分離血清和摘取卵巢組織，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 一般狀態(tài)及動(dòng)情周期 記錄小鼠的皮膚毛澤、飲食、排便及活動(dòng)情況，記錄體質(zhì)量。建模期間每天8：00～9：00用自制棉簽在小鼠陰道內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)2～3圈；將小鼠陰道脫落細(xì)胞平鋪于載玻片上進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察動(dòng)情周期情況。

1.2.4.2 激素測(cè)定 采集建模完成后當(dāng)天和移植hUCMSCs后7 d、14 d各組小鼠眼眶靜脈血，于3 000 r/min條件下離心10 min；分離血清于-20℃條件下保存。用ELISA試劑盒檢測(cè)雌激素（estrogen，E2）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、抗苗勒管激素（anti-müllerian hormone，AMH）水平。

1.2.4.3 卵巢組織學(xué)形態(tài) 取各時(shí)期不同組的小鼠頸椎脫臼處死，摘取雙側(cè)卵巢組織與子宮組織；將一側(cè)卵巢放于-80℃冰箱備用，另一側(cè)卵巢組織及子宮放于4%多聚甲醛溶液中4℃條件下固定72 h；制備5μm切片，每隔10張取1片。用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察子宮、卵巢組織及各級(jí)卵泡[6]，分別計(jì)算原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、閉鎖卵泡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析聯(lián)合Bonferroni法進(jìn)行差異性比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠的一般情況和動(dòng)情周期比較

空白對(duì)照組小鼠活動(dòng)靈敏，皮毛光澤度等無(wú)明顯異常表現(xiàn)，對(duì)外界刺激的反應(yīng)性好，靈活性強(qiáng)。POF組小鼠活動(dòng)明顯減少、精神萎靡、攝食減少、皮毛光澤度下降等變化。hUCMSCs組在hUCMSCs移植后，小鼠活動(dòng)度有所增加、反應(yīng)靈敏、攝食量增加、皮毛有光澤等。POF組、hUCMSCs組在注射CTX后均發(fā)生動(dòng)情周期紊亂，表現(xiàn)為動(dòng)情間期延長(zhǎng)。

2.2 3組小鼠體質(zhì)量變化比較

建模完成后，POF組和hUCMSCs組小鼠體質(zhì)量與空白對(duì)照組比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而POF組小鼠體質(zhì)量與hUCMSCs組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。hUCMSCs移植后7 d及14 d，hUCMSCs組小鼠體質(zhì)量明顯增加，與POF組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組小鼠hUCMSCs移植前后體質(zhì)量水平變化比較Tab.1 Comparison of body mass changes before and after hUCMSCs transplantation in 3 groups

2.3 3組小鼠血清雌激素水平比較

建模完成后，POF組、hUCMSCs組血清E2均明顯降低，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。hUCMSCs移植后7 d及14 d，hUCMSCs組與POF組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組小鼠hUCMSCs移植前后E2水平變化比較Tab.2 Comparison of E2 levels before and after hUCMSCs transplantation in 3 groups

2.4 3組小鼠血清卵泡刺激素水平比較

建模完成后，POF組、hUCMSCs組血清FSH均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與7 d空白對(duì)照組相比，其14 d的FSH下降10.08%，POF組下降4.65%，hUCMSCs組下降3.28%。hUCMSCs移植后7 d，hUCMSCs組血清FSH水平與POF組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對(duì) 照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。hUCMSCs移植后14 d，hUCMSCs組血清FSH水平明顯降低，與POF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3組小鼠hUCMSCs移植前后FSH水平變化比較Tab.3 Comparison of FSH levels before and after hUCMSCs transplantation in 3 groups

2.5 3組小鼠血清抗苗勒管激素水平比較

建模完成后，與空白對(duì)照組比較，POF組與hUCMSCs組血清AMH均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與7 d空白對(duì)照組相比，其14 d的AMH下降25.44%，POF組下降22.29%，hUCMSCs組下降16.16%。hUCMSCs移植后7 d，hUCMSCs組血清AMH水平與POF組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；hUCMSCs移植后14 d，hUCMSCs組血清AMH水平下降，與POF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；hUCMSCs組血清AMH水平與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 3組小鼠hUCMSCs移植前后AMH水平變化比較Tab.4 Comparison of AMH levels before and after hUCMSCs transplantation in 3 groups

2.6 3組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)改變及卵泡計(jì)數(shù)比較

空白對(duì)照組小鼠卵巢皮質(zhì)及髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，各級(jí)卵泡排列有序，且顆粒細(xì)胞排列整齊、層次多。POF組可見(jiàn)卵巢組織萎縮，卵巢結(jié)構(gòu)混亂，顆粒細(xì)胞層排列凌亂甚至死亡，卵巢間質(zhì)嚴(yán)重纖維化，功能卵泡數(shù)目明顯減少，閉鎖卵泡增多。hUCMSCs組可見(jiàn)卵巢組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均有恢復(fù)，間質(zhì)纖維化減少，功能卵泡增多，均優(yōu)于POF組。見(jiàn)表5、圖1。

圖1 3組小鼠hUCMSCs移植后卵巢組織HE染色結(jié)果（HE，100×）Fig.1 HE staining images of ovary tissue after mice hUCMSCs transplantation in 3 groups(HE,100×)

表5 3組小鼠hUCMSCs移植后卵泡計(jì)數(shù)比較Tab.5 Comparison of follicle counts after hUCMSCs transplantation in 3 groups

續(xù)表5Continous Tab.5

2.7 hUCMSCs移植后對(duì)小鼠子宮組織的影響

空白對(duì)照組子宮內(nèi)膜發(fā)育良好，間質(zhì)疏松，腺體豐富。POF組小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育不良，間質(zhì)血管明顯減少、腺體數(shù)量少。hUCMSCs移植后，hUCMSCs組子宮腺體和血管數(shù)量明顯增加。見(jiàn)圖2。

圖2 3組小鼠hUCMSCs移植后子宮組織HE染色結(jié)果（40×）Fig.2 HE staining images of uterus tissue after mice hUCMSCs transplantation in 3 groups(40×)

3 討論

干細(xì)胞治療相比起傳統(tǒng)、冗長(zhǎng)的藥物治療，不僅效果顯著，也能縮短整個(gè)治愈周期。間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌有利機(jī)體生長(zhǎng)、更新和修復(fù)的細(xì)胞因子及外泌體，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)，同時(shí)還具有抑制炎癥及雙向免疫調(diào)節(jié)的功能。干細(xì)胞的歸巢效應(yīng)，可以?xún)?yōu)先向炎癥區(qū)域和損傷的組織歸巢，從而更好地發(fā)揮血管生成、抗氧化應(yīng)激、抗炎作用[8]。有研究表明hUCMSCs可為女性子宮內(nèi)膜疾病[9]、卵巢癌[10]、不孕癥[11]等婦科疾病臨床治療提供新的種子細(xì)胞，為開(kāi)辟治療婦科疾病的新途徑提供了理論依據(jù)。

CTX是臨床中常用于非特異性細(xì)胞周期抗癌藥物的烷化劑，具有很高的生殖毒性，對(duì)卵巢組織造成不可逆的損傷[12]。有研究報(bào)道，當(dāng)CTX的劑量達(dá)到100 mg/kg時(shí)，可造成卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量減少一半以上[13]。Liu TE等[7]報(bào)道在單次腹腔注射CTX（70 mg/kg），在第14天后卵巢質(zhì)量沒(méi)有明顯變化。Sun M等[14]報(bào)道，腹腔注射CTX（50 mg/kg）連續(xù)15 d后，POF小鼠在1個(gè)月內(nèi)體質(zhì)量與正常小鼠相比仍然較低。筆者實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射CTX后，小鼠出現(xiàn)E2、AMH水平明顯降低，F(xiàn)SH水平明顯升高，卵巢萎縮，間質(zhì)纖維化嚴(yán)重，各級(jí)卵泡數(shù)的降低，閉鎖卵泡數(shù)目增加。說(shuō)明筆者實(shí)驗(yàn)建立的動(dòng)物模型符合POF的激素水平狀態(tài)和組織學(xué)形態(tài)。Mohamed SA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在移植hUCMSCs后，可通過(guò)旁分泌途徑改善卵巢微環(huán)境的狀態(tài)，提高E2水平，降低FSH的水平，減少閉鎖卵泡，修復(fù)卵巢組織。Yin N等[16]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在移植hUCMSCs后，可表達(dá)血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）基因，通過(guò)激活應(yīng)激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）信號(hào)通路調(diào)控CD8+、CD28-T細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)hUCMSCs移植后POF小鼠卵巢功能的恢復(fù)。筆者研究結(jié)果表明，與7 d空白對(duì)照組相比，其14 d的FSH下降10.08%，POF組下降4.65%，hUCMSCs組下降3.28%?？赡苡捎跈C(jī)體FSH持續(xù)刺激卵巢，通過(guò)負(fù)反饋?zhàn)饔媒档托∈篌w內(nèi)E2水平，進(jìn)而加速了卵巢促性腺激素受體活性，減少卵巢對(duì)FSH的敏感性，造成改善卵巢功能作用減弱，會(huì)引起卵泡質(zhì)量及數(shù)量減少，進(jìn)而影響其卵巢恢復(fù)的時(shí)間。同時(shí)說(shuō)明可增加干細(xì)胞移植次數(shù)、劑量及提高歸巢率增加其利用率，可能會(huì)改善FSH持續(xù)刺激卵巢，可減緩顆粒細(xì)胞的凋亡和抑制卵泡閉鎖，促進(jìn)卵巢微環(huán)境改變。

AMH是由卵巢中顆粒細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，AMH可通過(guò)抑制卵泡的募集，降低卵泡對(duì)促卵泡雌激素的敏感性，減少優(yōu)勢(shì)卵泡的形成，減慢卵泡池的過(guò)快衰竭[17]。由于AMH水平不隨月經(jīng)周期的變化而變化，檢測(cè)穩(wěn)定性?xún)?yōu)于其他性激素，AMH水平具有很好的周期內(nèi)和周期間的穩(wěn)定性，可以很好地預(yù)測(cè)卵巢的反應(yīng)[18]。筆者實(shí)驗(yàn)顯示，在hUCMSCs移植后14 d，hUCMSCs組血清AMH明顯得到改善；與7 d空白對(duì)照組相比，其14 d的AMH下降25.44%，POF組下降22.29%，hUCMSCs組下降16.16%。結(jié)果說(shuō)明，hUCMSCs移植后AMH水平明顯得到改善。分析原因是hUCMSCs可抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，恢復(fù)卵巢激素水平，促進(jìn)不同階段卵泡細(xì)胞的發(fā)育，對(duì)化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的POF修復(fù)卵巢功能的作用得到強(qiáng)化。有項(xiàng)研究報(bào)道在移植間充質(zhì)干細(xì)胞后可抑制POF大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡并改善卵巢功能儲(chǔ)備。

筆者研究結(jié)果說(shuō)明hUCMSCs移植可以改善由化學(xué)治療藥物造成的卵巢儲(chǔ)備功能下降的狀況。hUCMSCs移植可改善卵巢微環(huán)境的狀態(tài)，從而可以提高E2，降低FSH的水平，改善卵泡功能。盡管hUCMSCs移植能有效緩解卵巢功能的下降，但能否使其卵巢功能恢復(fù)到年輕小鼠水平，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

目前干細(xì)胞移植存在的問(wèn)題：①移植細(xì)胞計(jì)數(shù)的最優(yōu)選擇，細(xì)胞在外界的活性及在體內(nèi)存活率；②干細(xì)胞移植后在小鼠卵巢內(nèi)發(fā)揮最大效應(yīng)的時(shí)間；③干細(xì)胞移植后不能排除這些細(xì)胞的致瘤性，也不能評(píng)估幼鼠是否會(huì)出現(xiàn)異常、突變等情況[19]。

綜上所述，hUCMSCs移植可促進(jìn)卵巢組織的修復(fù)，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，提高卵巢功能，進(jìn)而改善卵巢的儲(chǔ)備。此外，hUCMSCs移植改善POF小鼠卵巢功能的機(jī)制尚不完全清楚，仍需開(kāi)展更深入的研究，為POF提供最有效的最新的途徑。