劉 麗，萬辰杰，王 碩，李崇崇，柯林楠

隨著生物瓣膜材料和技術(shù)的不斷進(jìn)展，以及對(duì)機(jī)械瓣膜終身抗凝并發(fā)癥的重視，越來越多的臨床研究顯示了生物瓣的優(yōu)越性[1~4]。歐洲心臟病學(xué)會(huì)（European Society of Cardiology，ESC）/歐洲心胸外科學(xué)會(huì)（European Association for Cardio-Thoracic Surgery，EACTS）2017年發(fā)布的瓣膜性心臟病治療指南（ESC/EACTSguidelines for the management of valvular heart disease）[5]推薦50歲以下患者選擇機(jī)械瓣，70歲以上患者選擇生物瓣，50～70歲患者兩種瓣膜都可以考慮，臨床生物外科瓣膜植入患者年齡有降低的趨勢(shì)。生物瓣膜一般使用牛心包或者豬主動(dòng)脈瓣制作，優(yōu)勢(shì)在于患者不需要終生服用抗凝藥物，但生物瓣膜發(fā)生瓣膜毀損和再次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)更高，再次開胸手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)比首次手術(shù)明顯增高。隨著介入瓣的發(fā)展，2008年介入瓣膜瓣中瓣技術(shù)開始在臨床上逐漸嘗試使用[6~10]。介入瓣膜瓣中瓣通常不需要開胸和體外循環(huán)，瓣膜壓縮至輸送系統(tǒng)，經(jīng)導(dǎo)管植入至毀損生物瓣膜位置，患者創(chuàng)傷小，恢復(fù)快，尤其適用于不能再次承受開胸手術(shù)的高危患者。近2年來，中國(guó)國(guó)內(nèi)也開始開展瓣中瓣臨床研究[11，12]。但是介入瓣膜直接安裝在已毀損的外科生物瓣膜內(nèi)，導(dǎo)致植入的介入瓣面積更小，瓣膜跨瓣壓差增加，從而可能影響瓣膜壽命。目前介入瓣膜瓣中瓣臨床使用時(shí)間尚短，缺少長(zhǎng)期臨床研究數(shù)據(jù)[13~18]。筆者采用體外加速方法，對(duì)一種介入瓣膜瓣中瓣模式下耐久性能進(jìn)行研究，可作為介入瓣膜瓣中瓣臨床前體外評(píng)價(jià)的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

將介入瓣膜（規(guī)格23 mm、27 mm、29 mm）按照說明書通過輸送系統(tǒng)安裝在對(duì)應(yīng)規(guī)格外科生物瓣膜中作為實(shí)驗(yàn)樣品形成瓣中瓣。由于放入介入瓣之前利用外科瓣的支架彈性及特殊設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行了預(yù)擴(kuò)張，使得放入介入瓣膜后瓣口內(nèi)徑仍可維持原尺寸。所有測(cè)試環(huán)境參數(shù)模擬及標(biāo)準(zhǔn)參照為主動(dòng)脈瓣位。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

流體：0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

人工心臟瓣膜疲勞測(cè)試系統(tǒng)（提供100 mmHg的平均反向壓力，1 000次/分的加速頻率）、模塊化人工心臟瓣膜脈動(dòng)流測(cè)試系統(tǒng)（模擬主動(dòng)脈瓣部位流動(dòng)環(huán)境，提供生理壓力及流量波形，2～7 L/min的模擬心輸出量）（上海心瓣測(cè)試設(shè)備有限公司，中國(guó)）。差示掃描量熱儀（DSC 214 Polyma。Netzsch，德國(guó)）；雙光子共聚焦顯微鏡（A1R MP。Nikon，日本）。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的瓣膜安裝位置先安裝外科生物瓣膜（牛心包），進(jìn)行測(cè)試后利用其瓣架上的特殊裝置及材料本身的彈性用球囊將其內(nèi)徑擴(kuò)大，使得介入瓣膜放入后與原先測(cè)試的外科瓣膜有相同的瓣口內(nèi)徑。將介入瓣膜按照使用說明壓握至適用規(guī)格的輸送系統(tǒng)上，按實(shí)驗(yàn)管路通過輸送系統(tǒng)放入對(duì)應(yīng)規(guī)格的外科瓣膜中（實(shí)驗(yàn)瓣膜的規(guī)格為23/27/29 mm 3個(gè)尺寸），形成瓣中瓣模式。

1.2.2 耐久性能實(shí)驗(yàn)

耐久性能測(cè)試是評(píng)價(jià)瓣膜長(zhǎng)期有效性的體外測(cè)試方法。該實(shí)驗(yàn)?zāi)M瓣膜臨床使用條件及使用時(shí)間，對(duì)瓣膜的長(zhǎng)期使用性能進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)YY/T 1449.3—2016及ISO 5840-3：2013介入瓣膜標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于介入瓣膜一般考慮模擬臨床使用5年（2.0億次循環(huán)）過程中瓣膜的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用人工心臟瓣膜疲勞測(cè)試系統(tǒng)對(duì)組裝好的介入瓣膜瓣中瓣進(jìn)行耐久性能測(cè)試[19，20]。調(diào)節(jié)電機(jī)運(yùn)動(dòng)幅值及頻率，使得通過測(cè)試瓣膜平均跨瓣壓差為13.3 kPa（100 mmHg），至少95%循環(huán)達(dá)到通過閉合瓣膜的定義目標(biāo)壓差峰值13.3 kPa（100 mmHg），每個(gè)循環(huán)中至少有5%的時(shí)間里所受壓差是等于或大于13.3 kPa（100 mmHg）。

1.2.3 脈動(dòng)流參數(shù)測(cè)量

采用模塊化人工心臟瓣膜脈動(dòng)流測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)[19，20]。測(cè)試瓣膜每0.5億次進(jìn)行脈動(dòng)流性能測(cè)試。在平均主動(dòng)脈壓13.3 kPa（100 mmHg）、頻率為70次/分、模擬心輸出量為5.0 L/min的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)試瓣膜的平均跨瓣壓差、反流百分比、有效瓣口面積、泄漏量和關(guān)閉量。將0次、0.5億次、1.0億次、1.5億次、2.0億次的介入瓣膜瓣中瓣脈動(dòng)流性能測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比、分析。

1.2.4 瓣葉熱力學(xué)分析

分別取疲勞測(cè)試前后的介入瓣膜的瓣葉，用濾紙吸干表面水分，稱量約5 mg，置于差示掃描量熱儀的鋁制樣品盤中，密封加熱，起始溫度10℃，每分鐘升高2℃，最終溫度150℃。以吸熱峰值作為樣品的變性溫度。

1.2.5 瓣葉膠原纖維結(jié)構(gòu)分析

分別取疲勞測(cè)試前后的介入瓣膜的瓣葉，在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光設(shè)置為840 nm的激發(fā)波長(zhǎng)，以誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)依賴的自體熒光和二次諧波（second harmonic generation，SHG）產(chǎn)生。選擇檢測(cè)器前的低通濾波器采集膠原的SHG信號(hào)。探測(cè)器的針孔被設(shè)置為最大值以收集焦平面上產(chǎn)生的所有光。觀察膠原纖維的結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件線性回歸方法對(duì)耐久性能測(cè)試中介入瓣膜瓣中瓣脈動(dòng)流性能的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)瓣葉熱變性溫度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 3種介入瓣膜脈動(dòng)流參數(shù)測(cè)量結(jié)果

2.1.1 3種介入瓣膜脈動(dòng)流參數(shù)比較

每0.5億次后進(jìn)行脈動(dòng)流性能測(cè)試。23 mm瓣中瓣平均跨瓣壓差為1.92～1.98 kPa（14.4～14.9 mmHg），反流百分比為7.2%～3.3%，有效瓣口面積為1.45～1.66 cm2；27 mm瓣中瓣平均跨瓣壓差為0.92～1.64 kPa（6.9～12.3 mmHg），反流百分比為14.9%～3.3%，有效瓣口面積為1.88～2.17 cm2；29 mm瓣中瓣平均跨瓣壓差為0.72～1.02 kPa（5.4～7.4 mmHg），反流百分比為14.7%～3.9%，有效瓣口面積為2.24～2.54 cm2。見圖1～3。采用線性回歸方法對(duì)脈動(dòng)流測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在95%可信區(qū)間，平均跨瓣壓差、反流百分比和有效瓣口面積無顯著性變化趨勢(shì)。

圖1 3種介入瓣膜瓣中瓣平均跨瓣壓差比較柱狀圖Fig.1 Comparison histogram of mean valve difference pressure in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

圖2 3種介入瓣膜瓣中瓣反流百分比比較柱狀圖Fig.2 Comparison histogram of reflux percentage in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

圖3 3種介入瓣膜瓣中瓣有效瓣口面積比較柱狀圖Fig.3 Comparison histogram of effective valve area in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

2.1.2 3種介入瓣膜瓣中瓣反流量比較

介入瓣膜瓣中瓣反流量分為2部分，即泄漏量和關(guān)閉量。2.0億次疲勞測(cè)試過程中，23 mm瓣中瓣關(guān)閉量為1.40～0.82 mL，泄漏量為3.83～1.52 mL；27 mm瓣中瓣關(guān)閉量為4.03～1.29 mL，泄漏量為6.53～0.44 mL；29 mm瓣中瓣關(guān)閉量為3.63~2.12 mL，泄漏量為7.02～0.66 mL。見圖4。采用線性回歸方法對(duì)脈動(dòng)流測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在95%可信區(qū)間，29 mm瓣中瓣泄漏量明顯減小，差異有顯著性，其余泄漏量和關(guān)閉量均無顯著性變化趨勢(shì)。

圖4 3種介入瓣膜瓣中瓣反流量比較Fig.4 Comparison histogram of reflex in 3 of valve in valvetranscatheter heart valves

2.1.3 在標(biāo)準(zhǔn)條件下，脈動(dòng)流性能參數(shù)比較

介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均壓力、70次/分心率、5 L/min心輸出量下的脈動(dòng)流性能數(shù)據(jù)符合YY/T 1449.3—2016規(guī)定值。YY/T1449.3—2016《心血管植入物 人工心臟瓣膜 第3部分：經(jīng)導(dǎo)管植入式人工心臟瓣膜》（等同轉(zhuǎn)化于ISO 5840-3：2013）對(duì)于左心植入的介入瓣膜的最低脈動(dòng)流性能做了規(guī)定（表1）。從表1可以看出，經(jīng)過2.0億次疲勞測(cè)試的介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均壓力、70次/分心率、5 L/min心輸出量下的脈動(dòng)流性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全滿足該標(biāo)準(zhǔn)的要求，說明介入瓣膜瓣中瓣經(jīng)過2.0億次疲勞測(cè)試后仍具有良好的脈動(dòng)流性能。

表1 3種介入瓣膜瓣中瓣脈動(dòng)流性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Comparison pulsatile-flow testing performance in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

2.2 3種介入瓣膜熱力學(xué)分析測(cè)試結(jié)果

介入瓣膜瓣中瓣疲勞測(cè)試前后，瓣葉熱變性溫度下降（圖5），疲勞測(cè)試前瓣葉熱變性溫度為（105.40±0.92）℃，疲勞測(cè)試后瓣葉熱變性溫度為（98.10±0.50）℃（n=3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.031，P<0.05）。

圖5 3種介入瓣膜瓣葉熱力學(xué)分析測(cè)試曲線Fig.5 Thermodynamic analysis test curve in 3 leaflet in valve-transcatheter heart

2.3 瓣膜耐久性測(cè)試病理變化

耐久性能測(cè)試前后的介入瓣膜瓣中瓣瓣葉在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光激發(fā)波長(zhǎng)為840 nm，測(cè)試結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，經(jīng)過2.0億次疲勞測(cè)試后，瓣葉材料在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察到，膠原纖維形狀發(fā)生變化，由疲勞測(cè)試前卷曲的立體結(jié)構(gòu)，變?yōu)槠跍y(cè)試后波浪形線狀結(jié)構(gòu)，可能是部分化學(xué)鍵丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。

圖6 雙光子共聚焦顯微鏡下840 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的介入瓣膜瓣葉疲勞實(shí)驗(yàn)前后圖像Fig.6 Images of before and after leaflet in valve-transcatheter heart fatigue experiment at 840 nm excitation wavelength under two-photon confocal microscope

3 討論

隨著外科生物瓣膜植入時(shí)間的推移，越來越多的植入的生物瓣膜發(fā)生毀損或鈣化，介入瓣膜作為瓣中瓣的應(yīng)用逐漸增多，但由于介入瓣膜瓣中瓣植入時(shí)間還很短，目前沒有長(zhǎng)期臨床數(shù)據(jù)可以參考。筆者首次通過體外加速疲勞測(cè)試，模擬介入瓣膜瓣中瓣植入5年的使用時(shí)間（2.0億次瓣膜開閉），并對(duì)疲勞測(cè)試后瓣膜流體力學(xué)性能、瓣膜瓣葉的熱變性溫度、膠原蛋白纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

經(jīng)過2.0億次耐疲勞測(cè)試，介入瓣膜瓣中瓣平均跨瓣壓差無顯著變化，反流百分比減小，有效瓣口面積基本一致。其中瓣膜反流量包括2部分，瓣膜關(guān)閉過程中產(chǎn)生的關(guān)閉量和瓣膜關(guān)閉后發(fā)生的泄漏量。2.0億次疲勞實(shí)驗(yàn)過程中，瓣膜關(guān)閉量無明顯變化，但泄漏量在逐漸減小。說明瓣膜疲勞測(cè)試過程中，泄漏量減小是反流百分比減小的原因。瓣膜泄漏量減小說明3個(gè)瓣葉運(yùn)動(dòng)中配合度越來越好。

YY/T 1449.3—2016《心血管植入物 人工心臟瓣膜 第3部分：經(jīng)導(dǎo)管植入式人工心臟瓣膜》（等同轉(zhuǎn)化于ISO 5840-3：2013）對(duì)于左心植入的介入瓣膜的最低脈動(dòng)流性能做了規(guī)定，經(jīng)過2.0億次疲勞測(cè)試的介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均壓力、70次/分心率、5 L/min心輸出量下的脈動(dòng)流性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全滿足該標(biāo)準(zhǔn)的要求，說明介入瓣膜瓣中瓣經(jīng)過2.0億次疲勞測(cè)試后仍具有良好的脈動(dòng)流性能。

經(jīng)過2.0億次疲勞測(cè)試后，瓣葉材料的熱力學(xué)變性溫度降低，熱變性溫度是組織內(nèi)存在化學(xué)鍵的表現(xiàn)，這些鍵維持了蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間三維、四維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。疲勞測(cè)試后熱變性溫度降低，可能是一些化學(xué)鍵受到破壞，鍵合程度降低，瓣葉交聯(lián)程度降低。瓣葉材料在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察到，膠原纖維形狀發(fā)生變化，由疲勞測(cè)試前卷曲的立體結(jié)構(gòu)，變?yōu)槠跍y(cè)試后波浪形線狀結(jié)構(gòu)，表明部分化學(xué)鍵丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。

筆者對(duì)一種介入瓣膜瓣中瓣進(jìn)行耐久性能測(cè)試，并首次采用熱力學(xué)分析和雙光子共聚焦顯微鏡對(duì)耐久性能測(cè)試后的瓣葉進(jìn)行分析，從微觀角度對(duì)介入瓣膜瓣中瓣耐久性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。經(jīng)過2.0億次耐久性能測(cè)試，介入瓣膜瓣中瓣流體力學(xué)性能無顯著變化，但瓣葉在纖維結(jié)構(gòu)方面發(fā)生了變化，說明熱變性溫度和膠原纖維結(jié)構(gòu)對(duì)于評(píng)價(jià)生物瓣膜耐久性能具有一定意義。

4 結(jié)論

介入瓣膜瓣中瓣經(jīng)過2.0億次疲勞測(cè)試后，瓣葉膠原纖維結(jié)構(gòu)由完整的三維結(jié)構(gòu)變?yōu)榫€性二維結(jié)構(gòu)，熱變性溫度降低，但瓣膜脈動(dòng)流性能指標(biāo)未發(fā)生變化，且均滿足YY/T 1449.3—2016標(biāo)準(zhǔn)中介入瓣膜的脈動(dòng)流性能要求。說明疲勞測(cè)試后，介入瓣膜瓣中瓣微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但仍具有良好的流體力學(xué)性能。

5 不足和展望

筆者研究中將介入瓣膜放入完好的外科生物瓣膜中進(jìn)行測(cè)試，未模擬出外科瓣膜毀損甚至鈣化的情況，而這類情況的發(fā)生是患者需要放入瓣中瓣的主要原因。當(dāng)外科瓣膜發(fā)生毀損（鈣化），可能導(dǎo)致植入的瓣中瓣局部變形，從而影響瓣中瓣的耐久性能。由于毀損和鈣化情況多種多樣，很難選擇測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)模型。由于該模型的重要性，目前在收集臨床病例的影像數(shù)據(jù)，試圖建立具有代表性的瓣中瓣測(cè)試周圍錨定幾何模型。