李江，謝瑞

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，杭州 310000)

非諾貝特(fenofibrate，F(xiàn)NB)是一種安全高效的降脂藥物，最適用于治療高三酰甘油血癥及以三酰甘油增高為主的混合型高脂血癥[1]。FNB屬于難溶性藥物，幾乎不溶于水，使其在臨床上的應(yīng)用受到很大限制[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%新藥屬于難溶性藥物[3]，如何改善難溶性藥物的溶出速率一直是藥物制劑研究者需要解決的難題。傳統(tǒng)上常常將藥物微粉化，減小藥物粒子大小來提高溶出速率[4]。而目前多通過制備成固體分散體、納米晶體等途徑來改善藥物低水溶性問題[5-6]，取得很大進(jìn)展。更多研究者利用納米介孔材料運(yùn)載難溶性藥物制備固體分散體，包括介孔碳，介孔硅和介孔鈦等材料[7-10]。于超峰等[11]以介孔硅為載體制備他達(dá)那非的固體分散體，顯著提高藥物的溶出度。李鶴然等[12]利用介孔硅材料MCM-41對鹽酸左氧氟沙星較高吸附能力，改善釋藥行為。這是由于納米介孔材料具有穩(wěn)定有序的孔道，很大的比表面積和可控制的空間，很大程度限制難溶性藥物的粒子大小，使其以無定形狀態(tài)存在于介孔孔道中，從而提高藥物的溶出速率。筆者制備一種介孔硅材料載體SBA-3來提高難溶性藥物FNB的溶出速率，利用吸附法將FNB載入SBA-3孔道中制備載藥體系，并對載藥體系進(jìn)行相關(guān)表征、體外毒性、溶出實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 JEM-1010透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)；UV757CRT紫外分光光度計(jì)(杭州俊升科學(xué)器材有限公司)；DSC-60差示掃描量熱儀(日本島津公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(建湖縣大龍玻璃儀器有限公司)；ZRS-8G 智能溶出度測試儀(深圳市博大精科技實(shí)業(yè)有限公司)；TDP-1.5德科單沖壓片機(jī)(新昌縣德科機(jī)械有限公司)。

1.2試藥 非諾貝特(上海源葉生物科技有限公司，含量>99%，批號(hào)：20180322)；非諾貝特酸(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司，含量>98%，批號(hào)：20170502)；非諾貝特市售片(上海衡山藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170223)；吲哚美辛(鄭州市安達(dá)醫(yī)藥有限公司，含量>99%，批號(hào)：20171011)；十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB，上海雪捷化工有限公司，色譜級(jí))；鹽酸，正硅酸乙酯(天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司)。噻唑藍(lán)(MTT，江蘇奧賽康制藥有限公司，批號(hào)：070901)。

2 方法與結(jié)果

2.1SBA-3的制備 SBA-3的典型合成參照文獻(xiàn)[13-15]。CTAB 0.63 g溶解于鹽酸溶液，室溫下充分?jǐn)嚢?。在酸性溶液中緩慢滴加正硅酸乙酯，使CTAB：正硅酸乙酯：鹽酸：水的摩爾比為1：1：9：130，繼續(xù)攪拌45 min。得到白色沉淀物，在100 ℃進(jìn)行油浴3 h。濾過，清洗，室溫干燥過夜，并在空氣中823 K下煅燒6 h，獲得載體SBA-3。通過透射電鏡法對載體SBA-3的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行考察，結(jié)果見圖1所示，SBA-3呈現(xiàn)均一有序的介孔孔道，孔徑2～3 nm。

2.2載藥及載藥量的測定 通過藥物吸附法[16]將FNB載入SBA-3的納米介孔孔道中。先將FNB 100 mg充分溶解于三氯甲烷溶液1 mL里，加入適量載體SBA-3避光孵育4～5 h，離心，棄去上清液，對沉淀物進(jìn)行干燥，即得載藥體系FNB-SBA-3。取FNB-SBA-3粉末5 mg溶解于甲醇中，采用紫外-可見分光光度法測定載藥量，F(xiàn)NB的最大吸收波長為286 nm[17]。載藥量(%)=藥物FNB測得質(zhì)量/載藥體系FNB-SBA-3總質(zhì)量×100%。結(jié)果FNB在SBA-3中載藥量為43.03%。

圖1 SBA-3的透射電鏡圖

2.3載體及載藥體系的表征 通過差示掃描量熱法檢測藥物結(jié)晶度[18]，對FNB、SBA-3、載體和藥物混合物、載藥體系FNB-SBA-3進(jìn)行分析?？疾霧NB在SBA-3中的存在狀態(tài)。檢測條件：掃描范圍為50～100 ℃，掃描速度為10 ℃·min-1。掃描結(jié)果見圖2。FNB 的掃描曲線在82 ℃處具有一個(gè)明顯的特征吸熱峰，而SBA-3 沒有出現(xiàn)特征峰，且為一條平滑曲線。載體和藥物混合物的掃描曲線與FNB相似，特征峰位置一致，這表明藥物和載體之間沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。載藥體系FNB-SBA-3在82 ℃特征吸熱峰消失，這個(gè)現(xiàn)象表明有晶型的FNB在SBA-3介孔孔道中以無定形的狀態(tài)存在。

2.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察SBA-3的生物安全性。將處在對數(shù)生長期Caco-2細(xì)胞用胰酶消化，混勻后接種在96板中，埋板密度為每孔105個(gè)細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行加藥處理。用培養(yǎng)基將載體SBA-3分別稀釋成濃度為10，25，50，100，200，300，400和500 μg·mL-1。每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔4個(gè)，同時(shí)設(shè)4個(gè)未加藥孔作為對照。加藥處理24 h后，每孔加MTT 50 μL，孵育4 h。甩去上清液，每孔加入二甲亞砜(DMSO) 200 μL，避光震蕩15 min，酶標(biāo)儀在波長490 nm處檢測吸光度(A值)。SBA-3處理后Caco-2細(xì)胞的存活率分別為98.90%，100.03%，97.31%，95.69%，95.41%，94.17%，92.52%和90.66%，結(jié)果顯示SBA-3在不同濃度下，Caco-2細(xì)胞存活率都高于90%。即使在最大濃度500 μg·mL-1，細(xì)胞存活也較高，這表明SBA-3具有良好的生物安全性，可作為一個(gè)載體進(jìn)行給藥。

圖2 FNB、SBA-3、混合物和FNB-SBA-3的DSC圖

2.5體外溶出實(shí)驗(yàn) 采用2015年版《中華人民共和國藥典》的溶出度測定法槳法進(jìn)行檢測。檢測條件：溶出介質(zhì)為1%SDS溶液1000 mL，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。同時(shí)投入FNB原料藥100 mg，載藥體系FNB-SBA-3為232 mg(相當(dāng)于FNB100 mg)。分別在投藥后5，10，20，30，45和60 min，取樣5 mL，取樣后迅速補(bǔ)充溶出介質(zhì)5 mL。樣品用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，采用紫外-可見分光光度法，在最大吸收波長286 nm處測定FNB的吸光度。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)累積溶出度結(jié)果見圖3。FNB在5 min溶出度為5.82%，而FNB-SBA-3在5 min溶出度卻達(dá)到20.36%。當(dāng)FNB-SBA-3接近100%時(shí)，F(xiàn)NB的溶出度也只有30.96%。證明FNB為難溶性藥物，而SBA-3作為載體顯著地提高FNB的溶出速率。

圖3 FNB和FNB-SBA-3的累積溶出圖

2.6片劑的制備

2.6.1片劑制備 采用粉末直接壓片法[19-20]制備FNB-SBA-3片劑，精密稱取FNB-SBA-3量為232 mg(相當(dāng)于FNB 100 mg)和適量的輔料，過篩，混合均勻后，干燥，8 mm沖模進(jìn)行壓片。壓片后片劑表面光滑，色澤均勻，無斷裂粉碎現(xiàn)象出現(xiàn)。硬度均>50 N，符合片劑質(zhì)量要求。

2.6.2填充劑的種類選擇 每片質(zhì)量347 mg，崩解劑羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)30 mg，黏合劑羥丙基甲基纖維素(HPMC)3 mg和潤滑劑硬酯酸鎂2 mg，使用填充劑80 mg，選用常用乳糖、微晶纖維素和淀粉作為片劑的填充劑進(jìn)行篩選，考察不同填充劑對FNB-SBA-3自制片中FNB累積溶出度的影響。結(jié)果見圖4。3種填充劑乳糖，微晶纖維素和淀粉對FNB的累積溶出度沒有明顯的差別，表明填充劑的種類對溶出度的影響較小。淀粉可壓性差，而乳糖由于價(jià)格便宜，流動(dòng)性和可壓性良好，常作為粉末直接壓片的填充劑，所以本實(shí)驗(yàn)選用乳糖作為FNB-SBA-3自制片的填充劑。

圖4 填充劑種類對FNB-SBA-3自制片累積溶出度的影響

2.6.3黏合劑的種類選擇 每片質(zhì)量347 mg，填充劑乳糖 80 mg，崩解劑CMS-Na 30 mg和硬酯酸鎂2 mg，使用黏合劑3 mg，選用常用HPMC，CMC-Na和聚維酮(PVP)作為片劑的黏合劑進(jìn)行篩選，考察不同黏合劑對FNB-SBA-3自制片中FNB累積溶出度的影響。結(jié)果見圖5，結(jié)果顯示HPMC作為黏合劑時(shí)FNB的累積溶出度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)保持最高，60 min累積溶出度達(dá)93.30%，藥物釋放完全。而CMC-Na和PVP作為黏合劑時(shí)，60 min累積溶出度僅為83.95%，85.40%。因此本實(shí)驗(yàn)選用HPMC作為FNB-SBA-3自制片的黏合劑。

2.6.4崩解劑的種類選擇 每片質(zhì)量347 mg，填充劑乳糖 80 mg，黏合劑HPMC 3 mg和硬酯酸鎂2 mg，使用崩解劑30 mg，選用常用CMS-Na，低取代羥丙基纖維素(L-HPC)和干淀粉作為片劑的崩解劑進(jìn)行篩選，考察不同崩解劑對FNB-SBA-3自制片中FNB累積溶出度的影響。結(jié)果見圖6，結(jié)果顯示CMS-Na作為崩解劑時(shí)FNB的累積溶出度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)保持最高，藥物溶出能力最好。而L-HPC和干淀粉作為崩解劑時(shí)，藥物溶出速率都較低。因此本實(shí)驗(yàn)選用CMS-Na作為FNB-SBA-3自制片的黏合劑。

圖5 黏合劑種類對FNB-SBA-3自制片累積溶出度的影響

圖6 崩解劑種類對FNB-SBA-3自制片累積溶出度的影響

2.6.5FNB-SBA-3自制片的最優(yōu)處方 通過單因素考察法對填充劑，黏合劑和崩解劑種類進(jìn)行篩選，確定FNB-SBA-3自制片的最佳輔料，并添加適量的硬脂酸鎂作為潤滑劑，最佳處方：FNB-SBA-3為232 mg(FNB含100 mg)，乳糖80 mg，HPMC 3 mg，CMS-Na 30 mg，硬脂酸鎂2 mg。

2.6.6自制片和市售片體外溶出度的比較 通過體外溶出實(shí)驗(yàn)對FNB-SBA-3自制片和FNB市售片進(jìn)行比較。同時(shí)向溶出介質(zhì)中投入含有100 mg FNB市售片和自制片。分別在5，10，20，30，45和60 min進(jìn)行取樣，286 nm波長下采用紫外分光光度法測定FNB的A值。結(jié)果見圖7所示，市售片在10 min時(shí)FNB的累積溶出度為22.65%，而自制片在10 min時(shí)累積溶出度卻已經(jīng)達(dá)到39.27%。當(dāng)FNB-SBA-3自制片F(xiàn)NB的累積溶出度達(dá)93.30%時(shí)，市售片F(xiàn)NB的溶出度只有65.25%，表明自制片明顯改善了藥物溶出速率。

圖7 自制片和市售片的累積溶出度

2.7體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.7.1色譜條件 用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%醋酸溶液(75：25)為流動(dòng)相，流速1 mL·min-1，在波長286 nm下檢測血漿中FNB的含量。

2.7.2血樣采集 將12只健康家兔[體質(zhì)量(2.5±0.5) kg，動(dòng)物合格證號(hào)：211002300068496]隨機(jī)分成2組，每組6只，雌雄各半，給藥前禁食12 h。一組口服給藥FNB市售片，一組口服給藥FNB-SBA-3自制片。規(guī)格：含F(xiàn)NB100 mg。分別在給藥后0.08，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，10，12和24 h，耳緣靜脈取血2～3 mL，離心，取上層血漿，在-20 ℃儲(chǔ)存。

2.7.3血樣處理 向400 μL血漿中加入1 mol·L-1鹽酸溶液400 μL，甲醇20 μL和內(nèi)標(biāo)吲哚美辛溶液(200 μg·mL-1)20 μL，混合5 min。加入無水乙醚3 mL，混勻5 min，離心，取上層快速揮干。流動(dòng)相50 μL重懸，離心，取20 μL進(jìn)行高相液相色譜法(HPLC)分析[16]。

2.7.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 向400 μL血漿中分別加入0.25，0.5，1，2，4和8 μg·mL-1非諾貝特酸溶液20 μL，再加入200 μg·mL-1吲哚美辛20 μL，混合均勻，進(jìn)行血樣處理。非諾貝特酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，吲哚美辛作為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行HPLC分析。非諾貝特酸濃度(C)為橫坐標(biāo)，非諾貝特酸與吲哚美辛峰面積比(A)為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果回歸方程為A=1.534 6C+0.688 5，R2=0.982 6，結(jié)果表明血漿藥物在檢測范圍0.25～8 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.5精密度實(shí)驗(yàn) 取低濃度(2 μg·mL-1)、中濃度(4 μg·mL-1)和高濃度(6 μg·mL-1)非諾貝特酸處理后的血漿樣本，一天內(nèi)每個(gè)濃度樣本測定5次，為日內(nèi)精密度。連續(xù)5 d測定每個(gè)濃度樣本，為日間精密度。結(jié)果3個(gè)濃度下日內(nèi)精密度的RSD分別為5.38%，4.97%和4.26%，日間精密度的RSD分別為7.56%，9.34%和4.55%，RSD均<15%，符合要求。

2.7.6回收率實(shí)驗(yàn) 取低濃度(2 μg·mL-1)、中濃度(4 μg·mL-1)和高濃度(6 μg·mL-1)非諾貝特酸處理后的血漿樣本，每個(gè)濃度5個(gè)樣品，HPLC測非諾貝特酸峰面積。另取相同濃度的非諾貝特酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測峰面積?；厥章蕿檠獫{中非諾貝特酸與標(biāo)準(zhǔn)溶液非諾貝特酸的峰面積之比。結(jié)果3個(gè)濃度下回收率分別為81.1%，82.5%和80.1%，回收率均>80%，符合要求。

2.7.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取低濃度(2 μg·mL-1)、中濃度(4 μg·mL-1)和高濃度(6 μg·mL-1)非諾貝特酸處理后的血漿樣本，放置1，2和3 d。結(jié)果3 d內(nèi)非諾貝特酸與吲哚美辛峰面積比的RSD<5%，藥物在血漿中穩(wěn)定性良好，符合要求。

2.7.8體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) FNB市售片和FNB-SBA-3自制片在家兔體內(nèi)給藥后，體內(nèi)血藥濃度變化情況見圖8所示，結(jié)果顯示自制片的血藥濃度一直高于市售片的血藥濃度。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。給藥后2 h，自制片達(dá)最高血藥濃度6.02 μg·mL-1，而市售片僅為3.27 μg·mL-1。市售片半衰期(t1/2) 為2.35 h，自制片為4.14 h。結(jié)果表明FNB-SBA-3自制片不僅提高FNB在體內(nèi)的血藥濃度，而且延長藥物在體內(nèi)的存留時(shí)間。根據(jù)AUC自制片與市售片的比值，計(jì)算出相對生物利用度為181.83%，證明FNB-SBA-3自制片顯著地提高FNB在體內(nèi)的口服生物利用度。

3 討論

藥物按照水溶性和腸道滲透性進(jìn)行生物藥劑學(xué)分類。FNB屬于BCS 2類，是低溶解性和高滲透性藥物，DSC表征也證實(shí)FNB為晶型藥物，溶出速率低，這也是FNB導(dǎo)致其生物利用度低的主要原因。因此，本實(shí)驗(yàn)制備納米介孔材料來提高FNB溶出速率，提高體內(nèi)生物利用度。但由于FNB進(jìn)入體內(nèi)代謝為非諾貝特酸，檢測不到FNB原藥，所以用非諾貝特酸作為體內(nèi)檢測非諾貝特的標(biāo)準(zhǔn)品。

圖8 自制片和市售片在家兔體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線圖

表1 2種制劑藥動(dòng)學(xué)相關(guān)參數(shù)

介孔硅材料SBA-3的介孔孔道有序均一，限制FNB結(jié)晶程度，產(chǎn)生空間抑制作用，使藥物在SBA-3介孔孔道呈現(xiàn)無定形狀態(tài)，DSC表征也得到進(jìn)一步證實(shí)。根據(jù)Noyes-Whitney公式，粒子大小和比表面積都是決定藥物溶出速率的主要因素。SBA-3由于介孔孔道空間抑制效應(yīng)，使FNB粒子明顯減小，相對比表面積增大，從而使FNB的溶出速率增加，體外溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FNB-SBA-3相對于FNB的溶出速率明顯提高。但在家兔體內(nèi)FNB-SBA-3自制片與FNB市售片相比達(dá)峰時(shí)間相同，半衰期相對延長，其原因可能與體內(nèi)測定藥物為非諾貝特酸而不是非諾貝特原型藥物有關(guān)。FNB-SBA-3自制片生物利用度顯著提高，證實(shí)SBA-3作為載體對難溶性藥物FNB改善溶出速率具有很好的潛力。