蘇超，金姝娜，張麗君，黃榮增，宋成武，尹久

(1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院，武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，武漢 430065；3.宜昌市東陽光實業(yè)發(fā)展有限公司，宜昌 443300)

姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥根莖，是一種藥食同源的常用中藥。姜黃的主要活性成分為二苯基庚烷類，即姜黃素類化合物，其含量占原植物2%～8%[1-2]。姜黃素類成分具有眾多的藥理活性，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖等[3-4]。姜黃素類成分預防性藥理作用一直是眾多學者研究的熱點，尤其在針對糖脂代謝紊亂相關疾病具有極大的應用價值[5]。課題組前期建立姜黃素類成分的分離、提取、富集、純化工藝[6]，已使用高分辨飛行時間超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-QTOF-MS/MS)技術對姜黃素部位的成分進行表征，并且已對不同產地的姜黃進行姜黃素類成分的含量測定[7]。

鞘磷脂(sphingomyelins，SM)是一類由神經酰胺的C-1羥基上連接磷酸膽堿(或磷酸乙醇胺)構成的鞘脂。以軟脂酸及絲氨酸為原料先合成鞘氨醇后，再與脂酰CoA和磷酸膽堿合成的磷脂類成分。鞘磷脂是細胞膜及血漿脂蛋白中的重要脂質之一，具有廣泛而重要的生物學功能[8]。近年來，已有研究表明鞘磷脂與糖脂代謝紊亂相關疾病有著密切的聯系[9-11]。由于多不飽和脂肪酸在脂代謝異常過程中具有積極的預防保護作用[12-13]，因此研究藥物對于血清多不飽和鞘磷脂含量的影響非常必要。本實驗首先整合應用高分辨飛行時間液質聯用儀(LC-QTOF-MS/MS)和三重四級桿線性離子阱液質聯用儀(LC-QTRAP-MS/MS)建立小鼠血清多不飽和鞘磷脂的專屬性定性和定量分析方法；同時利用高脂飼料誘發(fā)高脂血癥動物模型，研究姜黃素類成分對高脂血癥小鼠血清多不飽和鞘磷脂的調節(jié)改善作用，為姜黃調節(jié)脂代謝紊亂的藥效作用機制研究提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF級)雄性昆明小鼠，體質量18～25 g，購于湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。所有小鼠在溫度(24±2)℃、相對濕度45%～65%、12 h光照循環(huán)的環(huán)境下適應性喂養(yǎng)。

1.2試藥 姜黃藥材購自廣東省高要市，并經湖北中醫(yī)藥大學生藥教研室鑒定為姜黃(CurcumalongaL.)；內標化合物丹參酮IIA(純度>98%)購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇、乙腈購自Fisher公司；分析純甲酸、甲酸銨購自國藥集團；超純水由Milli-Q 純水機制備；XDA-7大孔吸附樹脂購西安藍曉科技新材料股份有限公司(批號：20170710)。

1.3儀器 Triple TOFTM5600液質聯用儀(AB SCIEX 公司)；QTRAP 4000液質聯用儀為(AB SCIEX 公司)；HC-3618R離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；RT-9600 半自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)生化試劑盒購自南京建成生物科技有限公司(批號：20190727)。

1.4姜黃素類成分的提取、制備 參照前期實驗方法[6]，取姜黃藥材適量，粉碎，10倍量75%乙醇浸泡提取，濾過，旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至適當體積，30%乙醇溶解并上樣于XDA-7大孔吸附樹脂，繼續(xù)用30%乙醇洗脫至顏色淡黃，然后用75%乙醇洗脫，此部位即為姜黃素類成分富集部位，收集該部位洗脫液，旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，冷凍干燥，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5動物分組及造模給藥 以隨機數字表法將小鼠分為正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組，姜黃素類成分大、小劑量組，每組6只。所有小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，除正常對照組外，模型對照組，辛伐他汀組，姜黃素類成分大、小劑量組均給予高脂飼料(蛋黃10%，豬油10%，膽固醇1%，膽鹽0.2%，基礎飼料78.8%)，喂養(yǎng)30 d后，開始灌胃給藥；姜黃素類成分大、小劑量組給予姜黃素類成分富集部位，相當于生藥材20，10 g·kg-1·d-1(灌胃容積0.4 mL)，正常對照組和模型對照組給予等量純化水，辛伐他汀組給予辛伐他汀50 mg·kg-1·d-1；實驗周期4周，期間記錄各組小鼠體質量、進食量；實驗結束后，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉1 mL·(100 g)-1麻醉小鼠，摘眼球取血，靜置，4000 r·min-1離心15 min，分離血清，按照生化試劑盒方法，采用半自動生化儀檢測血清TC和LDL-C水平。

1.6LC-MS/MS分析樣品制備 取離心分離的血清50 μL，加入已經配好的丹參酮ⅡA(500 ng·mL-1)溶液50 μL，加入乙腈200 μL，渦旋10 min，冰浴超聲15 min，12000 r·min-1離心15 min，分離上清液。沉淀用90%含水乙腈200 μL提取1次，12000 r·min-1離心15 min，分離上清液，合并2次上清液，真空離心濃縮，冷凍干燥，用甲醇250 μL復溶，備用。

1.7小鼠血清鞘磷脂定性分析 LC-QTOF-MS/MS主要用于檢測多不飽和鞘磷脂的一級和二級精確分子量，對目標化合物進行定性分析。色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH Shield RP-C18(50 mm× 2.1 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；流速0.4 mL·min-1；進樣體積10 μL；流動相A為含0.1%甲酸、10 mol·L-1甲酸胺的水相，流動相B為乙腈有機相，梯度條件為：0～0.1 min，82%B；>0.1～15 min，82%→85%B；>15～20 min，85%→90%B；>20～24 min，90%→ 98%B；>24～27 min，98%B；27.1 min，82%B；>27.1～30 min，82%B；正離子模式檢測記錄數據；質譜參數：毛細管電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃；霧化氣：50 psi；加熱氣：50 psi；去勢電壓：140 V ；碰撞能量：40 eV；一級分子量掃描范圍為100～1250；二級分子量掃描范圍為50～250。

1.8小鼠血清鞘磷脂相對定量分析 對于鞘磷脂類成分分析方法的建立，是基于課題組前期工作完成[14]。LC-QTRAP-MS/MS主要用于檢測上述已定性分析后確定的多不飽和鞘磷脂目標化合物的相對定量。色譜條件同“1.7”項；各項質譜參數如下：毛細管電壓：5500 V；離子源溫度：500 ℃；霧化氣：50 psi；加熱氣：50 psi；去勢電壓：140 V ；碰撞能量：40 eV；采用正離子模式下LC-QTRAP-MRM(多反應監(jiān)測模式)，即離子對檢測方式進行相對定量分析。

1.9方法學驗證

1.9.1日內精密度考察 取小鼠血清提取物，按“1.8”項下方法，1 d內平行進樣6次，計算各鞘磷脂類成分相對峰面積的RSD。

1.9.2日間精密度考察 取小鼠血清提取物，按“1.8”項下方法，連續(xù)3 d平行進樣6次，計算各鞘磷脂類成分相對峰面積的RSD。

1.9.3基質效應考察 取小鼠血清提取物，按“1.8”項下方法，以不同進樣量(2，5，10 μL)進樣，根據各鞘磷脂類成分MS信號考察基質效應。

2 結果

2.1姜黃素類成分對高脂血癥小鼠體質量、血清TC和LDL-C的作用 實驗期間，所有小鼠均無異常死亡；各組小鼠的日均進食量比較差異無統(tǒng)計學意義。實驗結果見表1，與模型對照組比較，經過4周灌胃給藥治療，姜黃素類成分可以顯著降低高脂血癥小鼠體質量、血清TC和LDL-C水平，在下調血清TC和LDL-C方面，姜黃素類成分大劑量組效果優(yōu)于小劑量組。

2.2小鼠血清中多不飽和鞘磷脂的定性分析 鞘磷脂在正離子質譜模式中可以裂解出184.073 3典型的碎片(圖1)，分子結構中含有2個N原子，因此鞘磷脂的分子量均為偶數，可以很好將其與磷脂酰膽堿區(qū)分開(結構中只有1N原子，分子量為奇數)。

采用PeakView SoftwareTM軟件中前體離子過濾(Precursor ion filter)功能，可以確定血清中鞘磷脂類成分。同時，結合目標化合物的高分辨質譜一級精確分子量，可以得到各化合物的分子式，進而計算出不飽和度；最后，經過對數據系統(tǒng)分析，共鑒定出小鼠血清中16個多不飽和鞘磷脂類成分(多不飽和脂肪酸是指脂肪酸鏈上具有兩個或兩個以上的雙鍵)，結果見圖2、表2。

2.3方法學驗證 于1日內平行進樣6次測定小鼠血清提取物，16個多不飽和鞘磷脂類化合物相對峰面積RSD為3%～12%，表明日內精密度良好；連續(xù)3 d平行進樣小鼠血清提取物6次，各化合物相對峰面積RSD為3%～16%，表明日間精密度良好；以不同進樣量(2，5，10 μL)考察基質效應，根據各化合物的MS響應值計算RSD，結果為8%～14%，因此可以認為本研究基質效應干擾較小。

表1 5組小鼠體質量、血清TC和LDL-C的檢測值

圖1 鞘磷脂SM(d18：1/16：0)的結構特征及其在正離子模式中典型碎片離子

2.4小鼠血清中多不飽和鞘磷脂的相對定量分析 采用MRM模式，利用已知的離子對(分子離子峰作為母離子；184.0733碎片離子作為子離子)和保留時間，對所有檢測到的多不飽和鞘磷脂進行相對定量分析。圖3中所有點的含義為目標成分峰面積(與內標相比后)與模型對照組小鼠血清中該成分的峰面積(與內標相比后)的比值，即變化倍數關系。經過數據分析，與正常對照組比較，高脂血癥模型小鼠血清中多不飽和鞘磷脂呈現顯著的下降趨勢(黑色點均在紅色點右邊)，而姜黃素類成分具有顯著的回調改善作用，且偏離紅色中心越遠，則效果越明顯。

圖2 基于LC-QTOF-MS/MS的血清多不飽和鞘磷脂提取離子流質譜圖

表2 LC-QTOF-MS/MS定性分析高脂血癥小鼠血清中多不飽和鞘磷脂類化合物

3 討論

姜黃對于高脂血癥的調節(jié)作用已被眾多文獻報道，有關其降血脂的作用機制大多集中在分子生物學方面，利用靶標性代謝組學方法探討其降血脂藥效作用機制不多。筆者在本研究整合利用2種功能互補的LC-MS/MS，基于靶標性代謝組學的方法[15]，對小鼠血清中多不飽和鞘磷脂類成分進行相對定量分析，并應用于姜黃素類成分調節(jié)脂代謝紊亂的藥效學研究，實驗結果表明高脂血癥小鼠血清中多不飽和鞘磷脂類化合物的相對含量較正常小鼠顯著降低，而姜黃素類成分具有顯著的改善作用，并趨向于正常小鼠回調該類脂質分子。已有文獻報道高脂血癥與血清中的多不飽和脂肪酸含量密切相關[16- 17]。由于血清中大部分脂肪酸來源于三酰甘油或磷脂類成分，而鞘磷脂屬于磷脂的一種，隨著鞘磷脂的水解，會伴隨有鞘氨醇和游離脂肪酸生成[18]。因此，同時監(jiān)測血清中多不飽和鞘磷脂的相對含量，篩選具有生物學意義的鞘磷脂生物標志物，對于研究高脂血癥的發(fā)生、發(fā)展及預后具有重要意義。

圖3 小鼠血清中多不飽和鞘磷脂的相對含量變化

綜上所述，姜黃素類成分對高脂血癥小鼠血清中多不飽和鞘磷脂的回調作用可能涉及姜黃調節(jié)脂代謝紊亂的藥效作用機制，值得深入研究。項目后期將針對血清多不飽和鞘磷脂類成分的提取方法進行優(yōu)化，并進一步優(yōu)化質譜檢測方法，以期檢測到更多的該類成分并進行相應的定量分析，同時更深入地研究姜黃素類成分對多不飽和鞘磷脂類化合物相關代謝通路的影響。