郭彩會(huì)，李穎，孫雪，劉亞麗，宋浩靜，王祁民，董占軍

(1.河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050051；2.石家莊四藥有限公司，石家莊 052100)

氟康唑是一種新型三唑類抗真菌藥物，具有廣譜抗真菌作用、吸收快且完全、耐受性好、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，在體內(nèi)通過抑制真菌細(xì)胞色素P450(CYP)介導(dǎo)的14α-甾醇的去甲基作用，從而抑制麥角甾醇的合成，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜合成不足。廣泛用于各種深部真菌感染性疾病及淺表、黏膜真菌感染的治療[1]。國內(nèi)外研究氟康唑人體藥動(dòng)學(xué)和生物等效性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多[2-3]，但筆者未見飲食對中國健康人體內(nèi)的氟康唑藥動(dòng)學(xué)參數(shù)影響的相關(guān)報(bào)道，本研究以中國健康成年人為研究對象，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS) 法測定血漿氟康唑濃度，在空腹和餐后給藥條件下，研究氟康唑片在健康人群中吸收程度和速度的差異，評價(jià)高脂高熱量飲食對單次口服氟康唑片藥動(dòng)學(xué)的影響，同時(shí)評價(jià)空腹和餐后條件下氟康唑片的安全性，旨在為臨床用藥安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、對象與方法

1.1材料

1.1.1藥品 氟康唑片(輝瑞制藥有限責(zé)任公司，批號：H79933，規(guī)格：每片150 mg)；待測物信息：氟康唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號：100314-201605，含量：99.7%) 、內(nèi)標(biāo)：氟康唑-d4對照品(TLC Pharmaceutical Standards公司，批號：1132-051A1，含量：98.7%)?？瞻兹搜獫{來自健康受試者。

1.1.2儀器 LC-30AD 型 UPLC 系統(tǒng)(日本 Shimadzu 公司，配有 LC-30AD 型二元高壓梯度泵、CTO-20A 型柱溫箱、SIL-30AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器)；LCMS-8050質(zhì)譜儀(日本 Shimadzu 公司)。BP211D 型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，感量：0.1/0.01 mg)；Elmasonic S150 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用型超聲波清洗器(德國 Elma公司)；Sorvall ST16R 型高速冷凍離心機(jī)(美國 Thermo Scientific 公司)；MIULAB MIX-25P 型渦旋儀(杭州米歐儀器有限公司)。

1.2受試者選擇 本文研究高脂高熱量飲食對氟康唑片藥動(dòng)學(xué)影響，數(shù)據(jù)來源是研究項(xiàng)目“氟康唑片(150 mg)在健康受試者中隨機(jī)、開放、兩制劑、單次給藥、雙周期、交叉空腹/餐后狀態(tài)下的生物等效性試驗(yàn)”的統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告，本文僅對原試驗(yàn)方案中參比藥物氟康唑片結(jié)果進(jìn)行二次統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)方案經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。共入組健康成年受試者45例，所有受試者均知曉本試驗(yàn)的目的和要求，并簽署知情同意書。其中24例完成空腹試驗(yàn)，男15例(62.5%)，女9例(37.5%)，年齡(30.2±6.09)歲，體質(zhì)量(64.29±8.52) kg，身高(168.50±9.10) cm，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(22.59±1.85) kg·(m2)-1；21例完成高脂餐后試驗(yàn)，男12例(57.1%)，女9例(42.9%)，年齡(29.0±7.76)歲，體質(zhì)量(62.33±8.56) kg，身高(166.48±6.78) cm，BMI為(22.42±1.96) kg·(m2)-1。兩組年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、男女比例等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2.1入選標(biāo)準(zhǔn) ①年齡為≥18歲的男性和女性受試者；②男性體質(zhì)量≥50.0 kg，女性體質(zhì)量≥45.0 kg，BMI 19.0～26.0 kg·(m2)-1；③無心、肝、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)、精神異常及代謝異常等病史；④生命體征、體格檢查、臨床實(shí)驗(yàn)室檢查、12導(dǎo)聯(lián)心電圖、胸部X線片，結(jié)果顯示正常或異常無臨床意義者；⑤受試者自篩選之日起未來6個(gè)月內(nèi)無妊娠計(jì)劃且自愿采取有效避孕措施。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①過敏體質(zhì)，或有食物、藥物過敏史者，對氟康唑或?qū)ζ渌量╊愃幬?如酮康唑、伊曲康唑等)過敏者；易發(fā)生皮疹、蕁麻疹等過敏癥狀體質(zhì)者；②篩選前6個(gè)月內(nèi)有藥物濫用史或篩選前3個(gè)月內(nèi)使用過毒品；③篩選前3個(gè)月內(nèi)獻(xiàn)血包括成分血或大量失血(>400 mL)，接受輸血或使用血制品者；④體格檢查及血液分析、尿液分析、血生化、胸部X線片、心電圖檢查異常且具有臨床意義者。

1.3方法 本研究共開展空腹、餐后2個(gè)試驗(yàn)?？崭乖囼?yàn)篩選60例，合格24例，隨機(jī)入組24例；餐后試驗(yàn)篩選64例，合格21例，隨機(jī)入組21例(餐后試驗(yàn)受試者篩選困難，合格21例，雖未滿足方案規(guī)定的24例，但病例數(shù)符合相關(guān)法規(guī)要求，故以21例受試者開展餐后試驗(yàn))。兩組資料見表1。分別服用氟康唑片150 mg，比較空腹條件下和高脂餐后氟康唑藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的變化。

根據(jù)《以藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為終點(diǎn)評價(jià)指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]推薦餐后生物等效性研究采用高脂(提供食物中約50%的熱量)高熱量餐(3352～4190 kJ)(1 cal=4.19 J)。其中蛋白質(zhì)提供熱量約628.5 kJ，碳水化合物提供熱量約1047.5 kJ，脂肪提供熱量2095～2514 kJ。試驗(yàn)中提供的食物可由含類似量的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪的食物替代。高脂高熱量餐如未吃完，需稱重，保證吃掉的食物熱量>3352 kJ。

空腹試驗(yàn)24例受試者空腹過夜 >10 h，口服氟康唑片150 mg，溫水240 mL送服，給藥前1 h以及給藥后0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，6.00，12.00，24.00，36.00，48.00，72.00，96.00，120.00 h采集前臂靜脈血4 mL，至EDTA-K2真空采血管中，輕柔顛倒混勻。餐后試驗(yàn)于第 2 天早上服藥前 30 min 開始進(jìn)食高脂(提供食物中的熱量約50%)高熱量餐(3352～4190 kJ)(高脂餐成分見表2)( 30 min 內(nèi)結(jié)束進(jìn)餐)，進(jìn)食高脂餐后30 min時(shí)服用氟康唑片150 mg，溫水 240 mL送服，在高脂餐后至給藥前以及給藥后0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，6.00，12.00，24.00，36.00，48.00，72.00，96.00，120.00 h時(shí)采集前臂靜脈血4 mL至EDTA-K2真空采血管中，輕柔顛倒混勻。

空腹組和餐后組所采集的血樣在1 h內(nèi)4 ℃條件下離心(1700×g，10 min)，所有離心后血漿樣品將被分成2份，2 h內(nèi)存放于-60 ℃以下冰箱中，以供藥動(dòng)學(xué)分析。

1.4測定方法

1.4.1色譜條件 色譜柱：GL Sciences Inc.，InertSustain C18(2.1 mm×50 mm，3 μm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸，流動(dòng)相B：100%乙腈，梯度洗脫，0.50～1.30 min，15.0%→50.0%B；>1.30～1.60 min，50.0%→95.0%B ；>1.60～2.50 min，95.0%B；>2.50～2.60 min，95.0%→15.0%B；>2.60～3.50 min，15.0%B，流速：0.400 mL·min-1；柱溫：40 ℃；分析時(shí)間為3.5 min；進(jìn)樣量：5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 離子源：大氣壓化學(xué)電離(APCI)源，正離子模式；監(jiān)測方式：MRM 模式；接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；霧化器流量：3.00 L·min-1；加熱器流量：10.00 L·min-1；干燥器流量：10.00 L·min-1。氟康唑定量離子對為m/z307.10→220.10，駐留時(shí)間為100 ms，預(yù)四級桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q1 Pre偏差-15.0 V，碰撞能量(CE)為17.0 eV，預(yù)四級桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q3 Pre偏差-23.0 V；氟康唑-d4離子對為m/z311.10→223.10，駐留時(shí)間為 100 ms，Q1 Pre偏差-16.0 V，CE為18.0 eV，Q3 Pre偏差為-23.0 V。

1.4.3血漿樣品處理 樣品室溫下融化后，渦旋混勻；吸取樣品(校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品或測試樣品)30.0 μL至96孔板中，對于雙空白樣品或QC0樣品，加入空白基質(zhì)30.0 μL；加入內(nèi)標(biāo)溶液30.0 μL，對于雙空白樣品加入50%乙腈溶液30.0 μL；加入100%乙腈溶液180.0 μL，然后渦旋約10 min，在約4 ℃條件下1700×g離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液30.0 μL至已加入30%乙腈溶液270.0 μL的96孔板中，渦旋5 min，待進(jìn)樣。

表1 空腹試驗(yàn)與餐后試驗(yàn)健康受試者一般資料比較

表2 高脂餐成分

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Phoenix WinNonlin 7.0版軟件的非房室分析方法計(jì)算空腹和高脂飲食后單次服用氟康唑片150 mg后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并對其做描述性統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)比較空腹組和高脂餐組之間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1方法學(xué)考察 LC-MS/MS的方法學(xué)驗(yàn)證由蘇州國辰生物科技股份有限公司的質(zhì)量保證部門根據(jù)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程對方案、原始數(shù)據(jù)及報(bào)告進(jìn)行監(jiān)督及審核，并且檢查或者審核實(shí)驗(yàn)的實(shí)施與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程的符合性。

血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氟康唑的測定。氟康唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 10～5000 ng·mL-1，氟康唑線性關(guān)系好，準(zhǔn)確度及精密度結(jié)果見表3。血漿樣品中氟康唑提取回收率為95.0%～99.9%，內(nèi)標(biāo)氟康唑-d4 的回收率為 91.7%。氟康唑在 3750～25 000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，稀釋因子為 1：10時(shí)具有良好的稀釋可靠性。血漿樣本在-20 ℃條件下儲存28 d的穩(wěn)定性良好，-60 ℃條件下儲存28，90 d的穩(wěn)定性良好；血漿樣本在-60 ℃條件下經(jīng)歷5次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性良好；全血樣本于冰浴白光下放置2 h的穩(wěn)定性良好；基質(zhì)效應(yīng)( 包括溶血基質(zhì)效應(yīng)與高脂基質(zhì)效應(yīng)) 、殘留均不影響血漿中氟康唑的準(zhǔn)確定量。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明本方法可用于臨床試驗(yàn)血漿樣品的分析。

2.2血藥濃度-時(shí)間曲線 健康受試者空腹和高脂飲食后口服氟康唑片150 mg后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖1。

2.3藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 空腹和高脂飲食后氟康唑片150 mg后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4。

表3 血漿中氟康唑的精密度和準(zhǔn)確度

圖1 空腹或高脂飲食后健康受試者口服氟康唑后藥-時(shí)曲線圖

2.4飲食影響分析 空腹與高脂飲食后藥物動(dòng)力學(xué)見表3。與空腹給藥比較，高脂飲食后氟康唑平均最大血藥濃度Cmax降低16.77%(P<0.01)，tmax推遲約2 h(P<0.01)，但AUC并未明顯改變(P>0.05)。說明食物對氟康唑的吸收速度有顯著影響，對吸收程度無影響。

2.6安全性評價(jià) 本研究45例受試者在空腹或高脂飲食條件下口服氟康唑片150 mg后，空腹組3例受試者發(fā)生不良事件3例次，其中尿上皮細(xì)胞增高1例次，轉(zhuǎn)歸為消失，上呼吸道感染1例次，轉(zhuǎn)歸為緩解，轉(zhuǎn)氨酶升高1例次，轉(zhuǎn)歸為穩(wěn)定。 餐后組2例受試者發(fā)生不良事件2例次，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高1例，轉(zhuǎn)歸為消失，尿白細(xì)胞陽性1例，轉(zhuǎn)歸為消失，所有不良事件嚴(yán)重程度均為1級，均未發(fā)生嚴(yán)重不良事件和導(dǎo)致退出試驗(yàn)的不良事件。氟康唑可能對患者的肝功能有影響，服用藥物時(shí)需定期檢查肝功能。

表4 空腹和高脂飲食口服氟康唑片后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

LC-MS/MS適用于復(fù)雜基質(zhì)中微量藥物及代謝物的定量分析，在靈敏度、選擇性以及對藥物分析的適用性等方面有突出的優(yōu)勢，具有很高的精密度和準(zhǔn)確性，是非常成熟的生物分析技術(shù)[5]。本研究采用 LC-MS/MS 方法對氟康唑血藥濃度進(jìn)行定量分析，可實(shí)現(xiàn)氟康唑血漿分析的重現(xiàn)性和高靈敏度[6]。

氟康唑相關(guān)的常見不良事件為胃腸道癥狀包括惡心、腹痛、腹瀉，其次為皮疹、肝腎功能異常[7]，本研究出現(xiàn)的不良反應(yīng)均為輕度，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，安全性較好。

食物可能改變藥物的生物利用度，F(xiàn)DA認(rèn)為應(yīng)采用高熱量、高脂肪的食物作為標(biāo)準(zhǔn)餐來考查飲食對藥動(dòng)學(xué)的作用，以使食物的影響達(dá)到最大[9]。目前筆者未見國內(nèi)食物對氟康唑藥動(dòng)學(xué)影響的相關(guān)報(bào)道，本研究分析顯示高脂高熱量飲食會(huì)使氟康唑的吸收延遲，峰濃度降低，但不影響藥物的吸收程度，分析原因可能是進(jìn)食后，食物降低胃排空速率，使藥物到達(dá)小腸的時(shí)間延長，因此導(dǎo)致tmax延長，Cmax降低。此外，本研究與國外報(bào)道的氟康唑在高脂飲食后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)變化稍有不同，國外報(bào)道餐后給藥與空腹給藥相比，Cmax、 AUC0-t和 AUC0-∞差別不大[10-11]，可能與種族差異有關(guān)；另外，本研究因是二次分析，非交叉設(shè)計(jì)，也可能是與國外報(bào)道數(shù)據(jù)有差異的原因之一。

氟康唑?qū)儆谶量╊愃幬?，根?jù)抗菌藥物藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)特點(diǎn)其為時(shí)間依賴型長抗菌后效應(yīng)藥物，評估其PK/PD指數(shù)主要是AUC0～24/最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration MIC)，高脂高熱量飲食后其體內(nèi)藥物暴露量并未改變，但吸收延遲，峰濃度降低，因此建議中國人群空腹服用氟康唑片。本研究結(jié)果可為氟康唑片在中國人群的安全合理用藥提供重要參考依據(jù)。